齊墩果酸鹽的選擇及理化性質(zhì)研究

王路，施斌，孫晨，尹民，關(guān)凱琳，賀敦偉,*

（1.中國海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院，山東青島 266003；2.則正（上海）生物科技有限公司，上海 201807）

處方前研究旨在提供藥品研究中所需的必要數(shù)據(jù)（特別是原輔料和包裝材料的物理化學(xué)、物理機(jī)械力學(xué)和生物藥劑學(xué)特性），這些數(shù)據(jù)可能會影響處方設(shè)計、原料藥和藥品的生產(chǎn)方法，最終影響產(chǎn)品的藥代動力學(xué)、生物藥劑學(xué)特性以及產(chǎn)品的包裝穩(wěn)定性。

在大型制藥公司，有許多指導(dǎo)方針和標(biāo)準(zhǔn)來確定化合物的物理化學(xué)性質(zhì)是否良好。在所有重要的物理化學(xué)性質(zhì)中，熔點(diǎn)、分解起始溫度、顆粒的形態(tài)和粒徑、晶癖、結(jié)晶度、吸濕性、固體穩(wěn)定性、溶解度和滲透性是最重要的因素。

為了更好地了解預(yù)配方在藥物開發(fā)中發(fā)揮的作用，本研究選擇了齊墩果酸（OA）作為候選藥物進(jìn)行物理和化學(xué)表征。齊墩果酸廣泛存在于多種植物中，OA 及其衍生物具有抗真菌、抗病毒、利尿、降血糖和抗腫瘤以及護(hù)肝和抗炎等藥理作用[1-4]。根據(jù)團(tuán)隊前期觀測結(jié)果（未發(fā)表），在X 射線粉末衍射（XRPD）中原料藥表現(xiàn)了較差的結(jié)晶性，在差示掃描熱量法（DSC）中出現(xiàn)了冷結(jié)晶，在熱重分析（TGA）中，從環(huán)境溫度到120 ℃重量損失為1.593%，這可能是由于晶格中的溶劑或者水的損失導(dǎo)致。經(jīng)動態(tài)水蒸氣吸附（DVS）試驗(yàn)證實(shí)，在相對濕度為95%的條件下，該化合物的吸濕率為4.43%。OA 在pH 值為1 ～6的緩沖液中的溶解度小于0.001 mg/mL，在模擬胃液（SGF）、禁食狀態(tài)小腸液（FaSSIEF）和飽食狀態(tài)小腸液（FeSSIF）中的溶解度分別為0.081 mg/mL、0.001 mg/mL 和0.038 mg/mL。在人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）模型中測得的表觀滲透率為1.2×10-6cm/s。油水分配系數(shù)（LogP）和藥物解離常數(shù)（pKa）分別為4.67 和2.52。在臨床上使用的劑量是30 ～50 mg。根據(jù)溶解度、劑量（40 mg）和滲透率數(shù)據(jù)，計算出溶解度數(shù)（Dn）為1.510 9，劑量數(shù)（Do）為4.210 5，滲透性數(shù)（An）為1.340 0。根據(jù)生物制藥分類系統(tǒng)（BCS）的定義，OA 為BCS Ⅱ（高滲透性和低溶解性）化合物。對于這種化合物，溶解度和溶解性可能限制其吸收。此外，在晶型篩選中，OA 可以形成水合物、甲醇溶劑化物、乙醇溶劑化物和異丙醇溶劑化物。根據(jù)以上表征結(jié)果，發(fā)現(xiàn)OA 存在結(jié)晶度差、水合物和溶劑化物形成能力強(qiáng)以及溶解度較低等問題。

為了改善OA 的物理化學(xué)性質(zhì)，計劃對化合物進(jìn)行重結(jié)晶和成鹽反應(yīng)，并對所有鹽的理化性質(zhì)進(jìn)行表征；采用Johnson 法和Gastroplus 軟件，以滲透性、溶解度、溶出系數(shù)、粒徑及其logP 和pKa 為輸入數(shù)據(jù)，計算最大吸收劑量（MAD)。

1 材料與方法

1.1 材料

齊墩果酸，純度99.0%，成都超人植物化工發(fā)展有限公司；氫氧化鈉（NaOH）、甲乙酮，分析純，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；膽堿，分析純，鄭州浩力化工有限公司；氫氧化鉀（KOH），85%，美國Alfa Aesar公司；無水哌嗪，99%，美國Alfa Aesar 公司；異丙醇（IPA）、甲醇，色譜級，美國Sigma-Aldrich 公司；乙腈（ACN），色譜級，美國Burdick & Jackson 公司；乙酸乙酯，分析純，美國Fisher 公司；乙二胺，分析純，比利時Acros 公司。

Q1000 DSC 儀、Q500 熱重分析儀，美國TA 公司；S40K 型pH 計、MX5 電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；水冷ZX98-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海魯伊工貿(mào)有限公司；SHB-S ⅢA 型循環(huán)水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；DMLP 偏振光顯微鏡，德國Leica 公司；labquaker 三維旋轉(zhuǎn)振蕩器，美國Thermo Scientific 公司；1200 高效液相色譜（配備DAD 檢測器）、XDB-d C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，粒徑 5μm），美國Agilent 公司。

1.2 OA 的重結(jié)晶

稱量99.1 mg 齊墩果酸至20 mL 容量瓶中，加入4.0 mL 水飽和乙酸乙酯。將樣品在大約55 ℃下攪拌，緩慢加入7 mL 乙腈作為反溶劑直至?xí)尹c(diǎn)。樣品慢慢冷卻至大約25 ℃后，通過真空過濾將固體分離，在真空干燥箱中45 ℃干燥過夜，收率為74.97%。其中，收率=目的產(chǎn)物實(shí)際生成量/目的產(chǎn)物理論生成量×100%=生成目的產(chǎn)物的原料量/原料進(jìn)料量×100%（下同）。

1.3 OA 鹽的合成

取5 個20 mL 容量瓶，分別加入169.2 mg、115.0 mg、112.1 mg、114.8 mg、210.9 mg 重結(jié)晶齊墩果酸，然后分別加入5.885 mL 甲乙酮、4.000 mL 甲乙酮、4.000 mL異丙醇、3.000 mL 水飽和乙酸乙酯、8.000 mL 異丙醇。將5 份樣品在55 ℃下攪拌，分別加入370 μL 的1 mol/L NaOH水溶液、250 μL的1 mol/L KOH水溶液、1 000 μL 的0.25 mol/L 哌嗪甲醇溶液、500 μL 的0.25 mol/L 乙二胺甲醇溶液、460 μL 的1mol/L 膽堿水溶液。晶體逐漸析出形成懸浮液，將5 份樣品55 ℃繼續(xù)攪拌3 h，然后慢慢冷卻到25 ℃。通過真空過濾分離固體，并在真空干燥箱中45 ℃干燥過夜，分別得到OA 的鈉鹽、鉀鹽、哌嗪鹽、乙二胺鹽、膽堿鹽，收率依次為85.22%、87.74%、76.40%、45.52%、81.24%。

1.4 結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 X 射線粉末衍射（XRPD）分析

工作電壓：40 kV；工作電流強(qiáng)度：40 mA；檢測器：LynxEye 檢測器；掃描角度（2θ）：4°～40°；步長值為0.05°；掃描速度為0.05°/s；分析軟件：MDI Jade 軟件。

1.4.2 偏光顯微鏡

顯微照片通過佳能Power Shot S80 數(shù)碼相機(jī)連接偏振光顯微鏡獲得，其中目鏡放大10 倍，物鏡放大20 倍。粒徑用徠卡有限公司的測微尺（每格10 μm）測量。

1.5 理化性質(zhì)表征

1.5.1 DSC/TGA 分析

（1）差示掃描量熱：樣品（2 ～3 mg）在非密封鋁鍋中以5 ℃/min 的速率從25 ℃加熱到300 ℃。（2）熱重分析：樣品（約10 mg）在開放式鋁盤中以5 ℃/min 的速率從25 ℃加熱到300 ℃，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。

1.5.2 溶解度測定

在25 ℃下測定化合物在SGF、FaSSIF 和FeSSIF中的溶解度。過量的活性藥用成分（API，2 mg）懸浮在液體（1 mL）中，在三維旋轉(zhuǎn)振蕩器上恒溫旋轉(zhuǎn)（250 r/min）16 h，樣品用0.45 μm 孔徑濾膜過濾，并記錄濾液/上清液的pH 值。用高效液相色譜法分析濾液濃度。

1.5.3 DVS 分析

水分吸附-解吸等溫線采用動態(tài)蒸汽吸附儀測定。稱取約10 mg 樣品在25 ℃下用干燥氮?dú)膺M(jìn)行預(yù)干燥。相對濕度按照5%/min 的速度由0 升至95%或75%再降回到0%；增重平衡標(biāo)準(zhǔn)：設(shè)定每步相對濕度5 min 內(nèi)達(dá)到重量變化率（dm/dt）小于0.01%即為平衡；最長平衡時間：120 min。

1.5.4 水/水-有機(jī)相混懸平衡實(shí)驗(yàn)

每個10 mL 容量瓶中分別放入約25 mg 的化合物，分別加入400 μL 水、乙酸乙酯-水（體積比97.06 ∶2.94）和異丙醇-水（體積比4 ∶1）溶液。將小瓶密封并在旋轉(zhuǎn)儀上以250 r/min 的轉(zhuǎn)速25 ℃旋轉(zhuǎn)70 h，樣品經(jīng)過干燥后為固體粉末，進(jìn)行XRD分析。

1.5.5 固體穩(wěn)定性研究

將樣品在40 ℃、50 ℃、70 ℃、40 ℃/75%RH、50 ℃/75%RH 條件下分別存放7 d 和14 d，進(jìn)行穩(wěn)定性研究。保存結(jié)束后放置于-20 ℃的冰箱中，用高效液相色譜儀進(jìn)行含量、溶解度測定，以評估化學(xué)穩(wěn)定性。在不同的時間間隔測定DSC 和XRPD 以確定藥物的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。

1.5.6 色譜條件

進(jìn)樣量10 μL，EZchromElite 軟件控制色譜系統(tǒng)。流動相A 為0.025%三氟乙酸乙腈溶液，流動相B 為0.025%三氟乙酸水溶液，流動相組成為A∶B=80∶20。流速為1 mL/min，檢測波長為215 nm。

樣品制備：精密稱定25 mg 樣品，置100 mL 容量瓶，加入適量乙醇溶解樣品后稀釋定容，搖勻后得樣品溶液。

1.5.7 最大吸收劑量計算

本研究采用一種相對簡單的方法（Johnson 模型）來計算最大吸收劑量，如公式（1）～（3）所示[5-6]。

式中，MAD為最大吸收量，mg；S為pH=6.5（FaSSIE）或5.5（FeSSIE）時的溶解度，mg/mL；Ka為經(jīng)腸吸收速率常數(shù)，min-1；VSIW為小腸水容量，取250 mL；TSIT為小腸轉(zhuǎn)運(yùn)時間，取270 min；Peff為人體有效滲透率；R為人體小腸半徑，取1.5 cm；PCaco-2是Caco-2模型中的表觀滲透系數(shù)。為對比不同模型的計算差異，另外采用本團(tuán)隊開發(fā)的基于生理的藥代動力學(xué)（BSPK）模型對MAD進(jìn)行模擬，其中小腸轉(zhuǎn)運(yùn)時間取值為1 440 min，包括胃排空時間15 min，小腸通過時間200 min，大腸通過時間1 225 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 重結(jié)晶OA 及其鹽的結(jié)構(gòu)和基礎(chǔ)理化特性

OA 及其鹽的結(jié)晶形式見表1 和圖1 ～圖4。對于OA 重結(jié)晶樣品，此晶型有某種不明晶癖，粒徑為10 ～50 μm，從25 ℃升溫到127 ℃時失重為0.28%；該晶型在311.51 ℃開始熔化；吸濕性強(qiáng)，在0 ～75%相對濕度范圍吸濕增重為0.501 3%，在0 ～95%相對濕度范圍吸濕增重為0.601 8%。5 種OA 鹽晶體中哌嗪鹽吸濕情況較為樂觀（低于重結(jié)晶樣品），因此選擇OA 哌嗪鹽進(jìn)行后續(xù)表征分析。OA 哌嗪鹽從25 ℃升溫到187 ℃失重1.469%。在219.35 ℃時出現(xiàn)明顯的吸熱峰，此時TGA 失重10.23%。在311.90 ℃出現(xiàn)另一個吸熱峰，該峰可能是失去哌嗪后的游離OA 熔化產(chǎn)生。

圖2 樣品的DSC/TGA 熱圖

圖3 樣品的XRPD 圖

圖4 樣品的DVS 等溫線

表1 OA 及其鹽類的結(jié)構(gòu)和基礎(chǔ)理化特性

2.2 溶解度

如圖5 所示，OA 在SGF、FaSSIF 中的溶解度很差；雖然是游離酸，但OA 在SGF 中的溶解度高于FaSSIF 和FeSSIF，說明十二烷基硫酸鈉的加入比卵磷脂和牛磺膽酸等表面活性劑更能顯著提高OA 的溶解度。在SGF 中，OA 鈉鹽、哌嗪鹽、乙二胺鹽和膽堿鹽的溶解度也有所提高。在FaSSIF 中，OA 鈉鹽和乙二胺鹽的溶解度分別大幅提高了約562 倍和318倍。在FeSSIF 中，OA 鈉鹽、鉀鹽、哌嗪鹽、乙二胺鹽和膽堿鹽的溶解度分別提高了16.76、0.37、4.55、4.50、10.97 倍。就溶解度而言，OA 鈉鹽、OA 膽堿鹽是最佳的候選鹽型。

圖5 OA 哌嗪鹽的水/水-有機(jī)混合物混懸平衡XRPD 圖

圖6 OA 不同鹽型的溶解度

2.3 OA 哌嗪鹽的水/水-有機(jī)混合物混懸平衡試驗(yàn)

原始樣品和水/水有機(jī)混合物漿體樣品之間的XRPD 圖譜無顯著差異，表明該化合物在漿料（83%～100%水活度）中相當(dāng)穩(wěn)定，見圖5。

2.4 OA 哌嗪鹽的固體穩(wěn)定性

OA 哌嗪鹽在所選實(shí)驗(yàn)條件下均表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性（見表2），含量沒有明顯下降，HPLC 圖譜顯示有關(guān)物質(zhì)總量沒有明顯增加，即雜質(zhì)未明顯增加。在極端條件下（包括70℃和50℃/75%RH）暴露的樣品的DSC 圖也基本沒有變化（未展示）。

表2 OA 哌嗪鹽的固體穩(wěn)定性

2.5 OA 哌嗪鹽的最大吸收量

采用Johnson 模型和BSPK 模型計算的MAD，如表3 所示。Johnson 模型中，粒徑設(shè)置為10 μm；擴(kuò)散常數(shù)為0.000 005 cm2/s；當(dāng)顆粒半徑小于30 μm 時，擴(kuò)散層厚度等于顆粒半徑；若顆粒半徑不小于30 μm，則擴(kuò)散層厚度為30 μm；固體藥物濃度為1 200 mg/cm3[6]。BSPK 模型中，不考慮顆粒半徑范圍，固定擴(kuò)散層厚度等于顆粒半徑；其余條件與Johnson 模型一致。

表3 根據(jù)臨床所需劑量（40 mg）計算MAD

結(jié)果表明，Johnson 模型和BSPK 模型計算的禁食狀態(tài)下的重結(jié)晶樣品MAD分別為0.46 mg 和0.33 mg，遠(yuǎn)低于臨床給藥劑量40 mg。然而，攝食后MAD顯著升高，分別達(dá)到17.30 mg 和21.41 mg。但該MAD仍不能滿足臨床平均40 mg 的需求。而OA 哌嗪鹽的MAD在Johnson 模型模擬的空腹和飽腹?fàn)顟B(tài)下分別達(dá)到24.13 mg 和78.75 mg，在BSPK 模型模擬的空腹和飽腹?fàn)顟B(tài)下分別達(dá)到30.04 mg 和94.87 mg。因此，隨著飽腹?fàn)顟B(tài)下溶解度的提高，OA 哌嗪鹽可應(yīng)用于臨床，40 mg 時吸收率可達(dá)91%。

3 結(jié)論

本文以O(shè)A 為模型藥物，合成了鈉、鉀、哌嗪、乙二胺和膽堿的OA 鹽，在五種鹽類中，哌嗪鹽具有較低的吸水性，在95% RH 環(huán)境下，其吸水率為0.247 4%，其他鹽類在5%～80% RH 環(huán)境下可形成水合物。與游離酸相比，哌嗪鹽在SGF、FaSSIF 和FeSSIF 中的溶解度分別提高了6.80 倍、53.00 倍和4.55 倍。在BSPK 模型模擬的飽腹?fàn)顟B(tài)下，10 μm 粒徑下OA 哌嗪鹽的MAD達(dá)到94.87 mg。OA 可用于臨床使用劑量為40 mg，吸收率高達(dá)91%。這為進(jìn)一步開發(fā)OA哌嗪鹽的制劑奠定了基礎(chǔ)。