TLR4/MyD88在單一延長應激誘導的PTSD大鼠海馬中的表達及意義

趙亞楠， 黃德盛， 陳 云， 孫藝瑤， 覃偉林， 謝菊華

創傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是目睹或經歷創傷事件后出現的精神或心理疾病，主要表現為個體主動回避、警覺性增加、反復體驗創傷事件等［1］。據最新流行病學調查［2］發現，187例嚴重創傷患者中診斷為PTSD的可達28.34%，參與新冠疫情救治的3 762名護理人員中PTSD篩查陽性率高達53.8%［3］。PTSD 持續存在將可能導致患者工作效率降低、社交退縮、酗酒暴力，嚴重者甚至出現自殘自殺等行為，因而及時診斷及干預PTSD顯得尤為重要。但目前PTSD 的發病機制尚不清楚，如何有效預防和干預尚待進一步深入研究。Toll 樣受體4（Toll-like receptors，TLR4）是一類跨膜模式識別受體，可通過髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）將細胞表面信號傳遞到細胞核，激活NF-κB，進而誘導多種炎癥因子、趨化因子等表達，促進炎癥反應、破壞免疫穩態［4，5］。研究發現TLR4/MyD88 信號參與了許多疾病如癡呆、腦出血、慢性酒精中毒、抑郁等的發生發展，在神經炎癥、學習記憶、抑郁行為等調節上發揮了重要作用［5-7］。本研究擬采用國際公認的單一延長應激（singleprolonged stress，SPS）誘導PTSD，觀察Toll 樣受體4信號在單一延長應激誘導PTSD 中的表達變化，為PTSD 動物模型研究及其發病機制研究提供實驗數據與依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年雄性Wistar大鼠購自遼寧省長生生物有限公司，45只，體重160～200 g。將大鼠隨機分為健康對照組15只、PTSD 組30只（造模后4 d組、造模后7 d 組各15 只）。適應性喂養5～7 d 后，PTSD 組采用既往研究中單一延長應激建立動物模型，具體程序如下［5，6］：（1）禁錮大鼠2 h；（2）強迫游泳20 min；（3）休息15 min 后乙醚麻醉1～3 min致深度昏迷。隨后常規喂養至取材。

1.2 Morris 水迷宮 Morris 水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力。水迷宮設備由一個圓形恒溫水槽和一個帶視頻計算機跟蹤系統的攝像頭組成。水槽直徑1 m，水溫恒定，深度50 cm，分為4個象限。SPS刺激后連續5 d訓練大鼠尋找平臺2次，6 d移除平臺后，記錄大鼠到達平臺的蹤跡及所需時間（潛伏期）。比較健康對照組及PTSD模型組的平均潛伏期。

1.3 尼氏染色 SPS 刺激4 d、7 d 分別腹腔麻醉大鼠，麻醉成功后暴露出大鼠心臟，剪開大鼠右心耳后立即用生理鹽水灌流；隨后用4%組織固定液灌流，待大鼠肝臟發硬終止灌流。斷頭取大鼠腦組織并浸泡在固定液中，6 h后石蠟包埋、切片。常規脫蠟水化后，用1%的甲苯胺藍55 ℃溫箱孵育30 min，隨后蒸餾水沖洗5 min后伊紅染色10 s，繼續蒸餾水沖洗后梯度酒精分化、二甲苯透明、封片。最后光學顯微鏡下觀察健康對照組與PTSD組海馬神經元形態。

1.4 Western blotting 檢測 分別于SPS刺激4 d、7 d麻醉大鼠并斷頭取腦、剝離海馬組織。根據海馬重量加入裂解液，超聲粉碎后離心后取上清。應用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。測完濃度的蛋白置入99 ℃金屬浴中變性5 min。各組分別取同重量蛋白上樣，采用8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，待蛋白跑至電泳槽底部時轉為200 mA轉印槽轉膜1 h。隨后5%BSA 常溫封閉1.5 h，稍微清洗膜后加入相應一抗4 ℃過夜（TLR4：Samta 公司，1∶500 稀釋；MyD88：Abclone 公司，1∶500 稀釋；NF-κB： Abclone公司，1∶500稀疏；GAPDH：北京中杉金橋公司，1∶1 000稀釋）。TBST 充分洗膜后加入二抗孵育1.5 h。二抗孵育結束后TBST充分洗膜并ECL發光顯影。

1.5 統計學分析 將所得分析數據結果用（±s）表示，對獲得的條帶經Image J軟件分析，對各組灰度值TLR4/GAPDH、MyD88/GAPDH、NF-κB/GAPDH的比值進行數據分析。組間差異應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本間t檢驗，并以P＜0.05表示組間差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 Morris 水迷宮檢測結果 Morris 水迷宮是最常見的用于檢測嚙齒類動物空間記憶的常見方法。SPS 刺激后6 d 移除平臺后，健康對照組（Normal）與PTSD 組（SPS）典型的運動曲線及平均潛伏期見圖1，結果表明PTSD 組運動曲線相對雜亂、平均潛伏期明顯延長（P＜0.05），提示單一延長應激后大鼠空間記憶能力降低。

圖1 Morris水迷宮檢測結果

2.2 尼氏染色結果 為觀察單一延長應激對大鼠神經元形態的影響，我們采用尼氏染色觀察了兩組大鼠神經元的形態改變，觀察發現：健康對照組神經元排列規整，胞漿中充滿尼氏體。而單一延長應激刺激后，大鼠神經元尼氏體數量減少、胞漿染色明顯變淡（見圖2）。

圖2 兩組大鼠海馬神經元尼氏染色結果

2.3 TLR4/MyD88表達變化 單一延長應激后4 d、7 d 取材大鼠海馬組織檢測TLR4/MyD88 蛋白表達改變見圖3。PTSD 組TLR4 蛋白表達逐漸增加，SPS 刺激后7 d 組TLR4 水平較對照組有統計學差異（P＜0.05）。MyD88 的表達變化與TLR4一致，SPS刺激后7 d有顯著升高（P＜0.05）。這些結果提示PTSD大鼠海馬組織TLR4/MyD88 信號激活，這可能與其空間記憶受損有關。

圖3 Western blotting法檢測各組TLR4/MyD88蛋白表達

2.4 TLR4 下游指標NF-κB 的表達改變 為進一步了解TLR4/MyD88 信號通路的激活情況，我們進一步觀察了各組TLR4 下游指標NF-κB的表達改變，結果如圖4 所示。單一延長應激后4 d、7 d NF-κB 蛋白表達均明顯增加，較健康對照組均有統計學差異（P＜0. 05），進一步提示PTSD大鼠海馬組織TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路激活。

圖4 Western blotting法檢測各組NF-κB蛋白表達

3 討 論

PTSD 多見于嚴重創傷事件后，據報道超70%的成人在一生中會經歷創傷事件。在經歷創傷事件的人群中，約20%～30%可進一步發展為PTSD，飽受噩夢、持續回避等困擾［8］，但目前臨床上尚缺乏治療或干預PTSD 發展的有效措施，目前也只有少量抗焦慮、抗抑郁藥物被用于PTSD 的臨床治療。探討PTSD 的具體發病機制及有效干預靶點對PTSD 的臨床救治及干預至關重要。

目前大腦神經炎癥被認為是PTSD 病程發生發展的重要機制之一［9-11］。多因素作用下，免疫細胞激活、大量炎癥因子尤其是促炎因子的釋放可參與大腦皮質、海馬等關鍵腦區突觸可塑性、神經元存活等，進而影響學習記憶及導致抑郁焦慮情緒障礙［12］。據研究報道，單一延長應激可使促炎細胞因子表達增加、學習記憶能力下降，且在精神疾病的發生發展中有直接作用［13，14］。在小鼠外周注射脂多糖也可引起杏仁核、海馬、皮質等關鍵恐懼回路腦區炎癥反應增加，因而從神經炎癥探討PTSD發病機制可能為干預PTSD發生發展提供可能治療靶點。

TLR4/MyD88/NF-κB 是最常見的促進炎癥反應的信號通路。TLR4在神經系統中可分布于神經元、小膠質細胞及神經干細胞等［15］。脂多糖、病毒RNA、熱休克蛋白等病原或損傷相關分子模式被TLR4胞外部分識別后，可激活MyD88依賴途徑觸發核內信號，激活NF-κB 等，從而啟動炎癥因子、趨化因子、黏附因子等多種細胞因子的轉錄與表達。目前已有大量文獻表明TLR4/MyD88/NF-κB 參與了許多神經疾病的發生發展。例如，缺血性腦卒中病灶內炎癥細胞聚集、小膠質細胞激活，TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路激活，而抑制該通路，可減輕缺血性腦卒中所致腦損傷［16］。阿爾茨海默病模型小鼠TLR4/NF-κB 信號激活，給予TLR4 抑制劑可使小鼠小膠質細胞氧化應激、炎癥反應均明顯減輕［17］。

在本研究中，Morris 水迷宮結果顯示單一延長應激暴露后大鼠平均潛伏期延長，提示單一延長暴露可致小鼠空間記憶功能受損，直接驗證PTSD 造模成功。同時尼氏染色觀察發現大鼠海馬神經元尼氏體數量減少、胞漿染色明顯變淡，表明PTSD 模型大鼠海馬神經元受損。此外，單一延長應激刺激4 d、7 d 大鼠海馬TLR4、MyD88 表達均逐漸增多，同時其下游NF-κB 也均有同樣趨勢變化，表明單一延長應激可致大鼠海馬TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路激活。單一延長應激致大鼠海馬神經元損傷及空間記憶功能受損可能與其海馬TLR4/MyD88/NF-κB上調有關。TLR4/MyD88 信號通路激活可能是單一延長應激模擬PTSD 過程中海馬損傷的重要分子機制之一。

倫理學聲明：本研究方案經由沈陽醫學院倫理委員會審批（批號：SYYXY2021060102），項目實施過程中根據《實驗動物管理條例》等相關法律規定和規章要求，盡可能用最少量動物、盡量減少動物痛苦。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：趙亞楠負責起草論文；黃德盛、陳云負責實驗操作、研究過程的實施；孫藝瑤、覃偉林負責數據收集、統計學分析、繪制圖表；趙亞楠、黃德盛負責論文修改；謝菊華負責擬定寫作思路、指導撰寫文章并最后定稿。