PMQR與耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌喹諾酮耐藥機制的關系

馮 霞,劉小云,許晶晶

(徐州醫科大學附屬醫院:1.中心實驗室;2.檢驗科,江蘇 徐州 221002)

耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)的廣泛分布是對公共健康的巨大威脅,CRE的感染往往存在多藥耐藥,給臨床抗感染治療帶來很大困難,對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥是其中很常見的一種。喹諾酮類抗菌藥物自問世以來,在腸桿菌科細菌感染的治療中被頻繁用到,也因此產生了比較普遍的耐藥。關于喹諾酮類抗菌藥物耐藥機制的研究已經有很多報道,但是關于CRE對喹諾酮類藥物的耐藥機制報道并不多見。本研究通過分析質粒介導的喹諾酮耐藥基因(PMQR)在CRE中的分布,探討相關的耐藥機制,為臨床合理使用該類抗菌藥物提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2021年7月至2022年9月本院臨床分離非重復的43株CRE菌株,入選標準為對亞胺培南或美羅培南至少一種耐藥。本研究涉及的標本均為臨床標本的二次利用,不涉及醫學倫理方面的問題。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2儀器與試劑 VITEK-2 Compact 全自動微生物分析系統(法國生物梅里埃公司);聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀ProFlex4483636(Applied Biosystems);電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像分析系統GenoSens1880(上海勤翔科學儀器有限公司);基因擴增引物由上海捷瑞生物公司合成。2X Taq PCR MasterMix(VICMED),100 bp DNA Ladder[天根生化科技(北京)有限公司]。

1.3藥敏試驗 采用VITEK-2 Compact 全自動微生物分析系統進行藥敏試驗和菌株鑒定,藥敏試驗結果參照臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2021年的標準判斷。

1.4細菌DNA制備 煮沸法:取適量菌落加入100 μL無菌雙蒸水,充分混勻后100 ℃煮沸15 min,迅速放冰浴10 min,冷卻后12 000 r/min離心5 min,取上清液,-20 ℃保存備用。

1.5基因檢測 PMQR有qnrA、qnrB、qnrS、qepA、acc(6′)Ib-cr;碳青霉烯酶耐藥基因有KPC、NDM、IMP;β內酰胺酶耐藥基因有CTX-M15、SHV。應用PCR技術擴增,引物序列見表1,設計參考文獻[1-3]。反應體系及反應條件:反應體系總體積25 μL,mixTaq 12.5 μL,模板2 μL,上下游引物各1 μL,雙蒸水8.5 μL;95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s(退火溫度見表1),72 ℃延伸60 s,35個循環,最后72 ℃延伸5 min。PCR產物分析:1.5%瓊脂糖電泳,凝膠成像分析系統分析拍照。產物送上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

表1 PCR引物序列長度及退火溫度

1.6統計學處理 應用SPSS26.0統計軟件進行數據分析,計數資料以例數或百分比表示,組間差異性比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1藥敏試驗 收集到的43株CRE包括31株耐碳青霉烯類大腸桿菌(CRECO),12株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)。另外收集非CRE大腸桿菌6株和肺炎克雷伯菌6株作為對照分析。31株CRECO對環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均為96.77%,對諾氟沙星和莫西沙星的耐藥率均為93.55%。12株CRKP對環丙沙星的耐藥率為83.33%,對左氧氟沙星、諾氟沙星、莫西沙星的耐藥率均為66.67%。CRECO、CRKP均對多黏菌素和替加環素100.00%敏感。見表2。43株CRE對β內酰胺酶阻滯劑類藥物的耐藥率很高,其中對氨曲南耐藥率為79.07%,對其他β內酰胺酶阻滯劑類藥物耐藥率均在94.59%～100.00%;對復方磺胺甲噁唑片耐藥率為88.37%;對氨基糖苷類的阿米卡星耐藥率為44.19%,對妥布霉素耐藥率為55.82%。非CRE的6株大腸桿菌和6株肺炎克雷伯菌對上述藥物均敏感。

表2 CRECO與CRKP對臨床常用抗菌藥物的藥敏試驗結果(%)

2.2PMQR的檢測 43株CRE中,88.37%攜帶有1個或2個PMQR,其中 acc(6′)Ib-cr檢出率為83.72%,qnrS檢出率為69.77%,qnrB 檢出率為2.33%,沒有檢測到qnrA 和qepA。PMQR在CRECO與CRKP中的分布見表3。部分PMQR擴增結果見圖1。

注:M.Marker;1.qnrB;2.qnrS;3.acc(6′)Ib-cr;4.KPC;5.NDM;6.CTX-M15;7.SHV。

表3 PMQR在43株CRE中的分布情況

43株CRE中,對喹諾酮敏感的CRE株僅3例,且100.00%攜帶qnrS和acc(6′)Ib-cr基因,因此對喹諾酮敏感CRE的PMQR檢出率不低于喹諾酮耐藥CRE,見表4。

表4 PMQR在43株喹諾酮耐藥或敏感CRE中的分布情況

2.3碳青霉烯酶耐藥基因和β內酰胺酶耐藥基因的檢測 43株CRE中碳青霉烯酶耐藥基因檢測情況:KPC總體檢出率為32.56%,其中CRECO為19.35%,CRKP為66.67%,CRECO與CRKP中的KPC檢出率比較,差異有統計學意義(P<0.05);NDM總體檢出率為88.97%,CRECO和CRKP的NDM檢出率比較,差異無統計學意義(P>0.05);沒有檢測到IMP基因。β內酰胺酶耐藥基因檢測情況:CTX-M15檢出率為67.57%,SHV檢出率為83.23%,CRECO和CRKP中的CTX-M15和SHV檢出率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。部分耐藥基因擴增結果見圖1。

非CRE的6株大腸桿菌和6株肺炎克雷伯菌中的qnrS檢出率為19.37%,acc(6′)Ib-cr檢出率為15.78%,未檢出qnrB、qnrA 和qepA。SHV檢出率均為20.6%,未檢出NDM、KPC、IMP和CTX-M15。

3 討 論

最近幾十年來,CRE流行范圍越來越廣,而且呈現多藥耐藥的趨勢,這使得臨床抗感染治療的藥物選擇越來越局限。CRE通常也對喹諾酮耐藥,臨床上大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的耐藥很常見,所以研究喹諾酮CRE的耐藥機制很有必要。本研究著重探討PMQR與CRE喹諾酮耐藥的關系。

喹諾酮能夠特異性結合革蘭陰性菌的拓撲異構酶和螺旋酶,形成喹諾酮-酶-DNA三元復合物,其可以破壞DNA,從而抑制細菌復制[4]。1998年,PMQR在美國的CRKP中發現。qnr基因受到研究者關注,因為qnr可以編碼qnr蛋白,保護DNA拓撲異構酶和螺旋酶,介導喹諾酮耐藥的發生。另外,喹諾酮的耐藥機制也包括acc(6′)Ib-cr介導酶失活,qepA介導藥物泵出上調,gyrA和parC誘導的細菌外膜通透性改變。這些最終會降低藥物的敏感性,增加細菌對喹諾酮的抗藥性[4]。

本研究結果顯示,CRE中的PMQR檢出率為88.37%,其中氨基糖苷乙酰基轉移酶acc(6′)Ib-cr檢出率最高,為83.72%。有文獻報道,CRE的喹諾酮耐藥可能是acc(6′)Ib-cr介導的[5],acc(6′)Ib-cr能將特異性底物環丙沙星和諾氟沙星的哌嗪基乙酰化,從而介導這2個藥物耐藥[6]。acc(6′)Ib-cr還可以誘導氨基糖苷類藥物耐藥。本研究結果顯示,CRE中的qnrS檢出率為69.77%,qnrB檢出率為2.33%。有文獻報道,qnr基因可以上調gyrA和parC的突變,從而增加細菌對喹諾酮的抗藥性[7]。本研究中沒有檢測到qnrA 和qepA,提示喹諾酮的耐藥機制可能與細菌的泵出功能上調無關。

有文獻報道,CRECO對喹諾酮的耐藥性較CRKP強[8],從本研究的耐藥數據來看,也支持這一結論,但相應的PMQR在CRKP中的檢出率卻不低于CRECO,提示CRE對喹諾酮的耐藥機制較復雜,不僅僅取決于PMQR。本研究也分別分析了喹諾酮耐藥CRE與喹諾酮敏感CRE之間PMQR分布情況,沒有發現統計學意義。這一結果也可能與對喹諾酮敏感的CRE例數太少有關,本研究僅3例,1例CRECO和2例CRKP,3例均檢出acc(6′)Ib-cr和qnrS基因,對喹諾酮敏感的原因可能是3例均為低齡兒童,既往沒有喹諾酮用藥史。說明這3例CRE攜帶的PMQR并非臨床喹諾酮用藥誘導產生,而是通過質粒水平傳播獲得。事實上在收集CRE菌株的過程中,大多數菌株都呈現包括喹諾酮耐藥性在內的多藥耐藥性,對喹諾酮敏感的CRE很難找到。

本研究還觀察了CRE菌株的碳青霉烯酶耐藥基因和β內酰胺酶耐藥基因的分布情況,發現總體NDM檢出率高達88.97%,CRKP和CRECO中的MDM檢出率無差異。而KPC檢出率在CRKP和CRECO差異很大,CRKP中的KPC檢出率為66.67%,明顯高于CRECO中的19.35%,未檢出IMP。CTX-M15的總體檢出率達67.57%。說明本地區CRE中以NDM、CTX-M15和KPC為主,與之前文獻報道一致[3]。NDM屬于金屬β內酰胺酶,只對多黏菌素和替加環素敏感,與其他碳青霉烯酶耐藥基因相比,對公共健康威脅更大。編碼碳青霉烯酶的基因通常定位在質粒,這個質粒一般同時攜帶喹諾酮和氨基糖苷類耐藥基因[9-15],已有很多文獻報道在菌株間會發生多種耐藥基因的水平共轉移[3,16-18]。本研究中PMQR分布結果也佐證了這個結論。值得注意的是,在本研究中的12例非CRE對照菌株中,qnrS檢出率為19.37%,acc(6′)Ib-cr檢出率為15.78%,雖然遠遠低于CRE,但確實存在。非CRE對照菌株中均未檢出NDM、KPC、IMP和CTX-M15,對照菌株均對喹諾酮類藥物敏感,這也提示與PMQR相關的喹諾酮耐藥機制可能需要NDM、KPC和CTX-M15的參與。

本研究在收集標本的過程中,由于各種原因收集的標本例數不是很多,尤其CRKP例數較少,統計數據不能完全代表本地區流行病學意義,僅就PMQR在CRE喹諾酮耐藥機制中的角色進行探討。顯然PMQR參與了CRE喹諾酮耐藥機制,而且是與其他耐藥基因共同參與,而具體的耐藥機制還需要進一步的實驗佐證,這也是后續的研究方向。