小田塊中稻瘟菌營養體親和群復雜性研究

王謠，丁航，李聰，鄧清超

(長江大學 農學院，湖北 荊州 434002)

稻瘟菌(Magnaportheoryzae)是一種絲狀子囊真菌(Filamentous fungus)，其無性態為灰梨孢菌(Pyriculariaoryzae)，屬半知菌門(Deuteromycotina)梨孢屬(Pyricularia)；有性態稻瘟菌屬于子囊菌屬(Ascomycete)[1-2]為人工培養形式，目前在自然界中并未被發現。稻瘟病是世界上危害糧食作物水稻的重要病害，發病癥狀不一，其發生不受地域、季節的影響[3]，對全球的糧食安全生產造成極大威脅[4-5]。稻瘟病的防治措施主要包括化學藥劑防治、抗病品種選育等[6]。其中化學藥劑防治是最快、最直接的方法，但其對環境危害也是最大的，稻瘟病菌在與抗病品種互作中容易變異產生新小種，使得長期種植單一抗病品種往往在幾年后其抗病效果在自然界中會降低[7]。綜上所述，大力發展可替代的安全防控措施勢在必行，生物防治是稻瘟病防控研究和實踐的一個重要發展方向[8]。真菌病毒在植物真菌病害的生物防治方面所具有的實踐價值已日益凸顯，真菌營養體不親和性是影響弱毒相關真菌病毒生物防治應用的最主要因素。弱毒病毒在降低宿主的致病力方面起到了重要作用，是真菌病害自然降低的主要機制之一，在植物病害生物防治方面有著重要的應用價值。稻瘟菌中Partitiviridae科相關弱毒病毒Magnaportheoryzaepartitivirus 2 strain YC13(MoPV2-YC13)能顯著降低稻瘟菌分生孢子產量，降低了對活體大麥的致病性[9]；Chrysoviridae科病毒MOCV1會引起稻瘟菌菌絲生長形態、細胞形態出現異常，黑色素減少，生長速率下降，分枝明顯增多，同時出現產孢減少，氣生菌絲形成受阻等不正常狀態[10-11]。

真菌營養體親和性(vegetative compatibility，簡稱VC)指同一種真菌的不同菌株之間菌絲能夠相互融合，進而交換細胞質或核物質的特性。通常將具有相互親和能力的真菌菌株定義為一個營養體親和群(vegetative compatibility group，VCG)[12-13]，屬于同一VCG的菌株相互能夠在細胞融合后形成穩定的異核體；而屬于不同VCG的菌株間在細胞融合時就會發生營養體不親和 (vegetative incompatibility，VIC)反應，不能形成異核體并引發程序性的細胞死亡 (programmed cell death，PCD)[14-17]。VIC作為真菌的一種自我-非自我的識別機制[16]，阻止了異核體的形成從而抑制了一些侵染性有害因子，如真菌病毒、變異線粒體和超數染色體等在真菌種群內的傳播與擴散[17-19]。真菌病毒在田間傳播難易程度與種群營養體親和群(VCG)數量多少有關，VCG數量越多真菌病毒就越難傳播。低毒力病毒CHV1侵染板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)能夠引起板栗疫病菌毒力的下降，例如在防治歐洲板栗疫病時CHV1對栗疫病的生物防治已經取得了很大成功[20]，而在北美CHV1卻沒有成功防治板栗疫病，其中一個原因就是北美洲栗疫病菌的種群VCG比較復雜[16]。

本研究旨在通過不同菌株間進行VIC測定，明確小田塊中稻瘟菌群體VCG的復雜程度，以評估用弱毒真菌病毒在小田塊內防控稻瘟病的效率與可行性。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2021年9月于位于恩施市白果鄉兩河村的湖北省農業科學院所屬50 m×60 m的試驗田中，間隔10 m以上采集水稻穗頸瘟病樣，經單孢分離獲得本實驗所用菌株ES31～ES76。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌分離、純化

取水稻穗頸瘟病樣，剪成約1.5 cm長的小段，放入鋪菌培養皿中的濾紙上進行保濕培養，28 ℃黑暗培養18 h，通過體式顯微鏡可以觀察到病斑部位產生大量稻瘟菌分生孢子。將單個病樣的分生孢子抖落于水瓊脂培養基平板(d=9 cm)上，28 ℃培養1 d，在體式顯微鏡下觀察并用毛細管灼燒拉成的細針挑取水瓊脂培養基平板上單個分生孢子萌發形成的微菌落，轉移至新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)平板(d=6 cm)上進行純化培養。每個病樣挑取6個單孢菌株，在PDA平板上生長出來的單孢菌株在其菌落直徑達到3 cm左右，可從中選取1個菌株進行保藏。

1.2.2 稻瘟菌營養體不親和性測定

真菌菌株間的營養體不親和VIC檢測主要是采用對峙培養法(barrage test)[21]。參試菌株在PDA培養基上(d=6 cm)活化3 d后，于菌落邊緣切取2 mm×2 mm的幼嫩菌絲塊轉移到新的PDA培養基上(d=9 cm)進行對峙培養，接種的兩菌絲塊之間相隔0.50～0.75 cm，每個組合進行3次重復并對培養皿進行密封處理。28 ℃黑暗培養箱培養4～5 d之后，觀察PDA培養基(d=9 cm)上兩菌落交界處是否產生拮抗反應(barrage formation)，即是否出現一條肉眼可見的白色抗衡帶。若兩菌株間的菌落交界處沒有明顯的抗衡帶，即兩菌株菌絲完全融合并且能夠正常生長，則兩菌株為營養體親和(VC)；反之，則兩菌株為營養體不親和(VIC)。

1.2.3 數據處理與統計分析

通過Excel對所有參試菌株組合的VIC測定結果進行統計，對菌株之間親和的比例以及營養體親和群的劃分進行分析。

2 結果與分析

2.1 稻瘟菌不同菌株間對峙培養的表型

本實驗通過對不同菌株間兩兩進行對峙培養(barrage test)[21]，觀察記錄到配對培養結果顯示為親和與不親和兩種。親和型反應現象表現為Ⅰ型，在兩菌株交界處的菌絲完全融合且正常生長，沒有形成抗衡帶，其中A1、A2、A3分別為對峙培養的培養皿的正反兩面，以及透光條件下的反面；而不親和反應現象存在兩種主要類型：Ⅱ型，兩菌株菌絲交界的地方產生一條清晰的白色抗衡帶，B1、B2、B3分別為對峙培養的培養皿的正反面，以及透光條件下的反面；Ⅲ型，兩菌株菌絲交界的地方形成一條清晰的白色抗衡帶，且菌落顏色較淺的菌株在靠近抗衡帶附近的菌絲顏色也會加深，C1、C2、C3分別為對峙培養的培養皿的正反面，以及透光條件下的反面(圖1)。

2.2 稻瘟菌營養體不親和性測定

將46個菌株分別進行兩兩配對之后，對所有觀察到的對峙培養反應結果進行統計和分析，發現在1 058個(46×46)配對組合中，大多數配對組合(818對)表現為VIC，占配對組合總數的77.3%，表現為VC的配對組合數量較少(240對)，占配對組合總數的22.7%。

對數據進行深入分析，根據VCG的定義，可將 46個稻瘟菌菌株中的20個歸入16個互不親和的VCG中(表1)，其余的26個菌株由于與多個VCG的全部或部分成員親和，不能歸入任何VCG之中(表2)。需要注意的是，即使是屬于同一VCG的兩個菌株，與其他菌株的VC反應也并不完全相同，比如菌株ES31、ES45同屬于親和群1，ES45與ES30、ES31、ES33、ES36親和，但是ES31只與ES45、ES55親和。

表1 參試稻瘟菌株的VCG分析

表2 與多個VCG的全部或部分成員親和的菌株

3 討論

本文借鑒了前人的研究方法，在稻瘟菌上建立了一種鑒定營養體親和性的方法即對峙培養法(barrage test)[21]，并利用該方法對小田塊中稻瘟菌群體的營養體親和群復雜度進行了分析和評估。本實驗分離得到了46株稻瘟病病株，經過VIC測定和VCG分析后發現了16個互不親和的VCG，且其中12個VCG都只有一個成員，另外4個VCG也只有2個菌株，且2個同屬于一個VGC的菌株與其他菌株的VC反應并不完全相同；另外26個菌株能夠與兩個以上的VCG的全部或部分成員親和，不應劃分入任何VCG中。參試的46個菌株中，任何兩個菌株與其他菌株的VC反應都不完全相同。本研究顯示，即使在小田塊中，稻瘟菌群體也有著非常復雜的VCG結構。

稻瘟菌復雜的種群遺傳結構，是其具有快速變異性和高度環境適應性的原因和基礎。鄧云等[22]用抗性基因分子標記檢測福建省稻瘟病生理小種優勢種群，分析致病率，為農業生產布局優化方案。劉偉等[23]利用已知水稻鑒別品種對遼寧省野生稻瘟病菌進行生理小種鑒定，發現稻瘟病菌群體的生理小種結構非常復雜；李海倫等[24]采用群體遺傳學的方法，也發現在特定小環境中的稻瘟菌群體多樣性遠遠高于在水稻上分離得到的稻瘟菌群體。本研究從VCG的角度出發，從另一個側面也印證了之前的諸多研究，證明了即使在小田塊中，稻瘟菌群體也有著非常復雜的遺傳結構。

不同VCG菌株間的VIC反應會嚴重限制真菌病毒的水平傳播，影響弱毒相關真菌病毒對稻瘟病的生物防治效率。真菌病毒通常缺少體外傳播途徑，只能通過孢子釋放進行垂直傳播或通過菌株間的菌絲融合進行水平傳播，VIC成為影響弱毒相關病毒傳播和生物防治效率的最主要因素[18，25-27]。選擇了實驗室的帶毒稻瘟菌株與本實驗中的46個菌株采用對峙培養法進行培養，發現帶毒菌株與本實驗中的菌株均不親和，且病毒均未發生傳遞，再次證明了真菌病毒在不同營養體親和群間不易傳播。實驗室中其他菌株與帶毒稻瘟菌株進行對峙培養發現病毒傳遞成功的兩菌落接觸區出現扇變。本研究還發現，參試的約半數菌株可以與多個VCG的部分或全部成員親和，推測野生稻瘟菌群體中存在vic基因自然缺失的突變體[28]，或存在由非等位的vic基因控制的VIC反應[29]。

本文在前期研究中初步發現在自然環境中的稻瘟菌群體可能有著非常復雜的VCG，病毒在不同VCG間很難發生水平傳播。本研究為后續評估稻瘟病發生地區采用真菌病毒生物防治的難易程度提供一定的理論基礎以及為后續鑒定稻瘟菌親和性功能基因提供一定的基礎數據。

4 結論

本實驗對在恩施地區實驗田塊(0.27 hm2)中分離得到了46株的稻瘟病病株，將采集分離得到的稻瘟病病株經過VIC測定和VCG分析后發現，結果顯示，在恩施田塊采集的稻瘟菌菌株中有16個互不親和的VCG，并且多數VCG只包含1到2個菌株。這表明即使在小田塊中，稻瘟菌群體也比較復雜。雖然用于進行VCG測定的稻瘟菌菌株的數量仍然較少，而且只選擇了恩施稻瘟菌監測苗圃，但也能說明稻瘟菌群體的VCG復雜度高，VCG間的VIC反應在將來也許對弱毒相關病毒進行生物防治應用有不小的阻礙。在后續研究中將擴大研究范圍對更多不同地域的稻瘟菌群體的VCG復雜性進行分析，完善研究內容，以期能夠對我國的稻瘟菌群體的VCG復雜程度有一個更為完整和準確的評估。