蝴蝶蘭黑頭病的病原診斷和防治方法

周勤，徐丹彬，方麗，葉琪明，繆強，萬華建，邱春英，王漢榮*

(1.浙江省農業技術推廣中心，浙江 杭州 310021；2.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021；3.杭州市富陽區農業農村局，浙江 杭州 311499；4.杭州市西湖區農業技術推廣服務中心，浙江 杭州 310013；5.杭州市蕭山區農林業技術推廣中心，浙江 杭州 311200)

蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬植物，原產地為熱帶、亞熱帶地區，素有“洋蘭皇后”的美譽[1]。20世紀90年代末，蝴蝶蘭作為一款高檔花卉從中國臺灣引入大陸，其葉片寬厚碧綠、花色多彩俏麗、花型優美大氣，符合國人喜慶、熱鬧、團圓等傳統氣氛，結合其花期長等優點，成為年宵花和禮品花的首選[2]，廣受消費者的喜愛。近年來，隨著蝴蝶蘭趨向于平價化，浙江省蝴蝶蘭年交易量基本穩定在500萬株左右，銷售額達上億元，并有不斷發展的趨勢。但蝴蝶蘭在栽培過程中容易發生一種病害，肉質葉的基部發黑變褐導致莖基部腐爛，花農稱該病為黑頭病。目前，不同蝴蝶蘭品種黑頭病的發生差異較大，易感品種的病株率為5%～50%，催花抽梗后發病尤為嚴重。由于該病發病初期不易被發現，一旦發現難以防控，且發病速度迅猛，花農損失較大，成為遏制蝴蝶蘭產業發展的瓶頸之一。

為了促進蝴蝶蘭產業的快速健康發展，2021年浙江省啟動了農業重大技術協同推廣計劃項目，項目組調查了杭州蘭派農業科技有限公司、杭州百盛精準農業有限公司和浙江啟美生態農業有限公司等杭州市主要蝴蝶蘭生產企業的黑頭病發生情況和品種抗性等，鑒定了引起黑頭病的主要病原，并提出預防蝴蝶蘭黑頭病發生的關鍵節點和技術方法，為蝴蝶蘭產業的高質量發展提供切實有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集

2021年11月，在杭州蘭派農業科技有限公司、杭州百盛精準農業有限公司和浙江啟美生態農業有限公司等蝴蝶蘭種植基地分別采集數十個蝴蝶蘭黑頭病樣品，對莖基部的典型病斑用蔡氏光學顯微鏡AX10鏡檢，并保存備用。

1.2 病原的分離純化

采集黑頭病的典型病樣，并用組織分離方法進行分離純化。病健組織切成5 mm×5 mm的小塊，并用70%乙醇消毒40 s，用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干水分后，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上，于25 ℃霉菌培養箱黑暗培養5 d。將獲得的不同菌落的菌絲塊置于新的PDA培養基進行單獨培養。培養至產孢后，單孢純化獲得不同菌株，并保存備用。

1.3 致病性測定

將獲得的不同分離菌株在PDA培養基上培養5 d后，用5 mm打孔器從菌落邊緣打出菌碟，避開葉片主脈放置在健康的蝴蝶蘭品種LL29葉片上(4～5片葉)。以PDA培養基空白塊為對照，保濕48 h，于25 ℃光照培養箱(12 h光照/12 h黑暗)培養，每天觀察病斑的形成和癥狀特征。

1.4 分子鑒定系統性分析

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離物的基因組DNA，核糖體內部轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)擴增通用引物ITS1/ITS4[3]、甘油-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因內含子引物GDF1/GDR1[4]、肌動蛋白(Actin，ACT)引物ACT-512F/ACT-783R[5]、延遲因子(translation elongation factor 1-alpha，TEF)引物EF1-728F/EF1-986R[5]和β微管蛋白(β-tubulin，tub2)引物BT-2a/BT-2b[6]由北京擎科生物有限公司合成。炭疽菌以ITS+Act+GAPDH+Tub的順序，鐮刀菌以ITS+TEF的順序進行排列，將獲得的各基因串聯成數據集，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)，利用軟件Mega 7.0將分離到的菌株分別與已發表的10個炭疽病菌菌株和18個鐮刀菌菌株構建系統發育樹，設定Bootstrap為1 000。

1.5 黑頭病的品種抗性調查

調查了杭州蘭派農業科技有限公司、杭州百盛精準農業有限公司和浙江啟美生態農業有限公司等蝴蝶蘭種植基地中的21個蝴蝶蘭品種的黑頭病發生率，篩選出抗性品種。

2 結果與分析

2.1 病原診斷和癥狀描述

觀察蝴蝶蘭苗期、抽梗期和開花期的黑頭病病癥，并對這些病斑進行植物病理學的鏡檢、組織分離、病原純化鑒定以及致病性測定后，結果發現黑頭病可以細分為2類病癥，由不同的病原真菌侵染引起，分別為炭疽類(Colletotrichumsp.)[7]和鐮刀類(Fusariumsp.)，即蝴蝶蘭黑頭病是由炭疽類真菌引起的炭疽病和鐮刀菌類真菌引起的枯萎病2種病害組成。

炭疽病病斑常在莖基部出現，最初為褪綠或褐色小點，后變為圓形或不規則形黑色病斑，病斑后期變為灰白色，有時有輪紋，病部密生小黑點，濕度高時小黑點可分泌出猩紅色黏孢子團，或產生規則排列的白色絨毛狀小點。病斑擴展至整個葉柄主脈時葉片發黃或枯死，枯死的老葉正反兩面均可見密生小黑點。該病也在葉面上發生，可形成略凹陷的針點狀小斑點(圖1)。

圖1 由虎頭蘭刺盤孢侵染引起的蝴蝶蘭黑頭病的田間典型癥狀

枯萎病初發時病部為水漬狀褪綠病斑，后發展成半圓形或不規則形，病斑黑色，略凹陷，病部葉片常發紅或發黃。濕度高時，病部可出現白色霉層，發病莖部脆弱，易折斷。最后病斑擴展整個葉基部，葉片斷裂、脫落，病斑繼續向上向下蔓延，直至整株枯死。該癥狀蝴蝶蘭苗期、催花和開花等階段均可發病(圖2)。

圖2 由茄病鐮孢侵染引起的蝴蝶蘭黑頭病的田間典型癥狀

2.2 病原鑒定

根據蝴蝶蘭苗期、抽梗期和開花期發生的黑頭病病癥，我們發現黑頭病由炭疽類和鐮刀菌類2種病原真菌侵染形成。這2種病害癥狀和發生條件都非常相似，較難分辨。采用組織分離法從這2種蝴蝶蘭病樣中分離獲得數十個不同的分離物菌株。將這些分離物置于新鮮PDA培養基上于25 ℃黑暗培養。

炭疽類病原菌呈放射狀生長，初生菌絲白色，短絨毛狀，后變深橄欖色至黑灰色。該菌在PDA固體培養基上不易產孢，在液體PDA中25 ℃培養5 d可產生少量分生孢子。分生孢子透明，桿形，14.3～19.8 μm×5.0～5.4 μm。在寄主植物上可產生大量近球形黑色孢子器，嵌于葉組織內，具一個孔口，有的有剛毛。有性形態子囊孢子，桿狀，單孢，透明，1～2個油球，或油球不明顯。從菌落形態上初步判斷為虎頭蘭刺盤孢[7]。

鐮刀菌類在培養基上呈放射狀生長，白色絨毛狀，菌落背面為土黃色；產生大量的卵形小型分生孢子，8.0～16.0 μm×2.5～4.0 μm，以及少量馬特型大型分生孢子，兩端較鈍，基部細胞有足跟，3～5隔，23.1～58.4 μm×3.0～6.0 μm。根據菌落形態初步判斷為茄病鐮孢[8]。

2.3 致病性測定

將2種病原分離物培養5 d后接種至健康的蝴蝶蘭植株上，接種4 d后2種分離物的接種處均產生病斑。炭疽類分離物接種后產生的病斑為深褐色，病健交界清晰，有少許黃暈，病斑略凹陷，有時有輪紋。茄病鐮刀菌分離物接種后最初產生水浸狀淡褐色病斑，后期病斑顏色略變深，隨著病斑的擴展，病健交界模糊，周圍葉肉或整個葉片明顯變黃或變紅。這2種病原分離物對蝴蝶蘭均有較強的致病性。而對照植株無病斑。根據柯赫氏法則，從接種部位重新分離出了對應的相同病原物，因此，確認這2種病原分別為蝴蝶蘭黑頭病的2種病原菌(圖3)。

A—虎頭蘭刺盤孢接種后7 d；B—茄病鐮孢接種后7 d；C—空白對照。

2.4 蝴蝶蘭黑頭病的分子鑒定

使用Mega 7.0軟件，采用鄰接法拼接序列，將典型病原菌菌株的ITS rDNA基因、肌動蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(Tub)和甘油磷酸脫氫酶基因(GAPDH)序列和翻譯延長因子(TEF)與GenBank中的Colletotrichum屬和Fusarium屬菌株構建了系統發育樹(圖4)，分別以C.gloeosporioidesCBS112999和GibberellazeaeNRRL 29169為外組，結果表明，炭疽類菌株與已報道的盤長孢狀刺盤孢C.orchidearum類群構成了明顯的分支，并且相似性達到99%，鐮刀類菌株與F.solani類聚，且相似性達到了98%。

圖4 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢的序列進化樹

因此，根據形態和分子鑒定結果，確診造成蝴蝶蘭黑頭病的炭疽類病原菌為虎頭蘭刺盤孢(ColletotrichumorchidearumAlleschf.Cymbidii Allesch)[9]，造成蝴蝶蘭黑頭病的鐮刀類病原菌為茄病鐮孢(Fusariumsolanif.sp.Fabae Yu et C.T.Feng)。

3 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病的發生率

從杭州蘭派農業科技有限公司、杭州百盛精準農業有限公司和浙江啟美生態農業有限公司等蝴蝶蘭基地分別采集黑頭病樣品數十份，鏡檢并分離培養病原物。發現由C.orchidearum引起的黑頭病發生率最大，為62.5%以上，而由F.solani引起的黑頭病的發生率在14.8%～37.5%(表1)。其中F.solani引起的黑頭病主要發生在蝴蝶蘭苗期，其發生的比例明顯高于成株期。個別樣品的病斑則由其他病原引起，還有待進一步驗證。

表1 虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病的發生率

4 蝴蝶蘭品種對黑頭病的抗性差異

2021年11月，隨機調查了21個蝴蝶蘭品種的黑頭病發生情況(表2)，發現5個大花型中，金橘、仙桃、富樂夕陽的發病率為0，無黑頭病，為抗性品種。而16個中小花型中僅紅粉佳人、雪玉未發生黑頭病，其余品種均有不同程度的病害發生。

表2 蝴蝶蘭品種黑頭病發現情況調查

5 蝴蝶蘭黑頭病的發生流行規律

在溫室大棚內，由虎頭蘭刺盤孢和茄病鐮孢引起的蝴蝶蘭黑頭病具有相似的發生和流行規律，其主要以菌絲體和分生孢子器在病原組織內越冬，經農事操作和水滴氣流的傳播擴散。在蝴蝶蘭整個生產過程均可發病，植株在傷口、高溫高濕、澆水過量或當頭淋澆、排水通風不暢等情況下容易被誘發。

蝴蝶蘭黑頭病中，由虎頭蘭刺盤孢侵染引起的炭疽類黑頭病占多數，由茄病鐮孢引起的鐮刀類黑頭病占小部分。虎頭蘭刺盤孢以傷口侵入為主，具有較長時間的潛伏期，周年發病。可從氣生根或花梗抽出在葉柄上形成傷口入侵，為病害發生高峰期，該時期為預防炭疽病的關鍵時期。茄病鐮孢從肉質根系或傷口侵入，植株長勢弱、基質帶菌和通風排水不暢等情況下易誘發病害，以苗期發病為主。蝴蝶蘭黑頭病3—10月均可發生，春秋季棚內溫濕度高，為黑頭病發生的主要時期，提早做好病害的預防，控溫通氣，降低棚內濕度，是防控病害的關鍵。

6 蝴蝶蘭黑頭病的綜合防治技術

6.1 選用抗病品種

從杭州市3家蝴蝶蘭生產企業調查情況看，目前生產上常用的蝴蝶蘭品種中易感品種為雙色鳥、三色鳥、甜格格、LL29、大黃蜂、明日之星等，在生產中需謹慎使用。

6.2 把好基質和種植關

基質材料需充分消毒滅菌，減少病原菌的攜帶。蝴蝶蘭小苗換盆時要淺栽，裸露莖基，基質切勿沒過植株莖基部。

6.3 正確澆水和通風

換盆后一個月內應控制水分，養護過程忌大水漫灌，或從當頭灌澆，需從花盆邊緣澆入。選擇晴天澆水，每次澆透水后打開風扇增加空氣流通，降低局部濕度。

6.4 及時清理病源

平時加強巡園，及時清除植株上的老葉、病葉、枯枝、凍害或灼傷的葉片，隔離或清除傳染源。發現病葉應剪除，在傷口涂抹殺菌劑。若發病嚴重時，則整株清除。

6.5 合理施肥和溫濕度管理

施肥遵循“少量多次、薄肥勤施”的原則，出瓶后5～7個月適當降低氮肥比例，催花前1個月開始提高磷鉀比例；苗期溫度26～30 ℃，催花期溫度18～25 ℃；濕度60%～80%為宜，環境濕度達到90%以上時，開啟內循環，加強空氣流動。

6.6 減少傷口產生

裝箱前需控水，防止因基質過濕引起紙箱潮濕變軟，造成紙箱塌陷，壓傷植株。在運輸過程中需輕拿輕放，防止出現大量傷口。

6.7 適時化學防治

以防為主。換盆前后噴灑廣譜性殺菌劑，第一次澆灌肥水可與廣譜性殺菌藥物同時施用，如亮盾(精甲·咯菌腈)懸浮種衣劑2 000倍液，之后每2周噴施1次廣譜性殺菌劑；抽梗時蝴蝶蘭莖基部產生較大傷口，易感品種在長出花梗過程中易出現發病高峰期，催花前后為防控關鍵期，可用450 g·L-1咪鮮胺微乳劑1 000倍液、30%吡唑醚菌酯乳油2 000倍液、25%苯醚溴菌清可濕性粉劑600倍液中的1～2種藥劑，5～7 d噴1次，連噴3次。各種藥劑要交替使用，以防病菌產生抗藥性。換盆或運輸蘭株前后可噴藥1次，進行預防。