3 種Maillard 反應前體物質對稻草木質素腐解及腐殖質組成的影響

白成鑫 高嘉聰 曾檬 趙泓博 趙鑫 王帥 王楠

（1吉林農業科技學院 農學院，吉林 吉林 132101；2 吉林農業大學 農學院，長春 130118；第一作者：baichengxin123@126.com；*通信作者：wangnan664806@126.com）

稻草是水稻規模化生產的副產物，占農作物秸稈總產量的30%~40%[1]。稻草還田可改善土壤肥力，增加土壤孔隙，減少稻草因焚燒而引發的環境污染。在眾多還田方式中，稻草腐解再還田被視作是理想的方式。一般情況下，在東北地區水稻收獲后就已進入冬季，待春季轉暖后，距離插秧前較短的溫和期（3 月下旬至5 月中旬，4℃~15℃）是稻草腐解的關鍵時期，稻草本身木質素含量較高且不易腐解，微生物在較短的自然溫和期往往不能完全腐解稻草。探索稻草腐解的促進因素對于北方稻草離田腐解技術研究尤為關鍵。

稻草中木質素含量約為4.83%。稻草中的木質素成分是自然界中含量僅次于纖維素和半纖維素的芳香族高分子聚合物，稻草腐解過程伴隨著木質素的腐殖化，木質素腐殖化的結果是產生腐殖質（HS），但該過程往往既漫長又復雜，是稻草腐解成功與否的關鍵，在生產上尋求能催化稻草腐解進程的積極因素具有重要實踐指導意義。Maillard 反應是Cat、Gly 和Glu 3 種前體物質在δ-MnO2催化下進行非生物縮合的腐殖化過程，通過在稻草腐解中額外添加，各物質通過氧化與親核反應能夠聚合形成類腐殖質[2]，促進稻草腐解。也就是說，3 種Maillard 反應前體物質通過各類反應能夠促進稻草的腐殖化，其中，Glu 是微生物的直接供能物質，能夠明顯增加微生物活性，促進無機氮素固持、減少氮素流失，為菌絲體形成提供能量，促進芳香環的分解[3]；Cat 依據多酚理論易被氧化成醌類直接參與HS 的形成；Gly 水解產生低分子量有機酸能夠為多酚形成提供基礎材料，間接促進HS 的形成。WU 等[4]研究認為，在堆肥過程中，多酚、羧酸、氨基酸、還原糖和多糖5 種前體物質可通過木質素-蛋白質途徑、多酚途徑和Maillard 反應等機制促進HS 的形成[5]。張雪辰等[6]通過向牛糞、菌糠和雞糞組成的共堆肥體系中添加含有激發自然界微生物快速繁殖營養因子（速效碳源、氮源和微量元素）的發酵激發劑，驗證了其能有效促進堆肥有機碳礦化分解的結論。前體物質是調控堆肥HS 形成的關鍵[7]。本研究采用室內培養法，以稻草為基礎材料，通過上述3 種Maillard 反應前體物質的外源加入，從腐殖質組成角度揭示各前體物質在稻草腐解過程中的貢獻，為稻草高效腐解提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻草取自吉林農業科技學院北大地水稻試驗田，經風干、粉碎過0.25 mm 孔徑篩備用，其總有機碳、N、P2O5和K2O 含量分別為37.8%、1.93%、2.33%和0.76%。

微生物菌劑制備：稱取天津環微生物科技有限公司出品的秸稈腐熟劑（有效活菌數≥200 億cfu/g）1 g于100 mL 無菌水中，在28 ℃氣浴振蕩器中以120 r/min 的轉數振蕩提取2 h，靜止沉降30 min 后以3 500 r/min 的轉數離心15 min，收集上清液，其中活菌數≥1.8×108個/mL，主要包括木霉菌、芽孢桿菌、放線菌、假單胞菌、乳酸菌和酵母菌等。

1.2 試驗設計

試驗于2021 年5 月進行，采用室內培養法，準確稱取12.0 g 稻草粉末于100 mL 三角瓶中，用一定濃度的（NH4）2SO4溶液調節稻草粉末含水量60%和C/N 比為25∶1。試驗共設3 個處理，分別在裝有稻草粉末的三角瓶中添加5 mL 0.12 mol/L 的鄰苯二酚（Catechol）、葡萄糖（Glucose）和甘氨酸（Glycine），以添加等體積的蒸餾水為對照，分別用Cat、Glu、Gly 和CK 表示，每個處理在各培養時間下均重復3 次、設置3 個瓶，用無菌透氣膜封口，將上述處理對應的三角瓶置于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻至常溫后，在無菌操作條件下接種10 mL 微生物菌劑，再次用無菌透氣膜封口，啟動28 ℃的恒溫好氧培養，期間按恒重標準動態補水，使含水量始終穩定在60%，在培養0、45 和90 d時動態取樣，取樣后立即轉入50 ℃鼓風干燥箱中風干來終止微生物反應，磨細過0.25 mm 孔徑篩，備用。

1.3 測試指標及方法

在Kumada 方法上作修訂進行腐殖質組成分析[8]。稱取1.0 g 稻草粉末于100 mL 聚乙烯離心管中，加入30 mL 蒸餾水攪拌均勻，在70 ℃恒溫水浴振蕩器中提取1 h，離心（3 500 r/min，15 min），吸取上清液于50 mL容量瓶中，之后在含有殘渣的離心管中繼續加20 mL蒸餾水攪拌均勻，3 500 r/min 離心15 min，將此次上清液與前次合并，用蒸餾水定容，所獲溶液即為水溶性物質（water soluble substance，WSS）；在此前的殘渣中加入0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L Na2P2O7的混合液，于3 500 r/min 離心15 min，按上述步驟對殘渣進行二次提取，獲得的上清溶液為可提取腐殖酸（humic-extracted acid，HE）；離心管中殘渣用蒸餾水多次洗滌、離心，直至洗液近中性，將其轉入50 ℃鼓風干燥箱中烘至質量恒定，該沉淀即為胡敏素（humin，Hu）。

吸取30 mL HE 溶液，用0.5 mol/L 的H2SO4將其pH 調至1.0~1.5，置于70 ℃水浴鍋中保溫1.5 h，靜置過夜，出現絮狀沉淀，次日將含有沉淀的溶液過濾于50 mL 容量瓶中并定容，此溶液為富里酸（fulvic acid，FA）；用稀酸淋洗濾紙上的沉淀，再用0.05 mol/L 溫熱的NaOH 將沉淀溶解于50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，獲得胡敏酸（Humic acid，HA）堿溶液，采用外加熱-重鉻酸鉀氧化法測定總有機碳（TOC）含量及WSS、HE、HA 和Hu 組 分 的 有 機 碳 含 量（CWSS、CHE、CHA和CHu），差減法（CHE-CHA）計算FA 組分的碳含量（CFA）并由此計算胡富比（HA 組分有機碳含量與FA 組分有機碳含量之比，CHA/CFA）；采用北京普析通用儀器有限責任公司生產的TU-1901 型紫外可見分光光度計測定HE 堿溶液的400 nm 和600 nm 處的光密度（A400nm和A600nm），計算色調系數（△lgK=lgA400nm-lgA600nm）。

1.4 數據處理

采用Excel 2003 軟件對數據進行整理并繪圖，用SPSS 18.0（PASW Statistics 18）軟件對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 對稻草腐解進程總有機碳（TOC）含量的影響

由圖1 可知，隨著培養時間的延長，Cat、Glu、Gly和CK 的TOC 含量均呈降低趨勢。與0 d 相比，培養90 d 后，Cat、Glu、Gly 和CK 處理下的TOC 含量分別降低了17.8%、22.9%、18.0%和13.3%。與CK 相比，添加Maillard 反應底物的3 個處理對TOC 礦化分解作用均有所促進，其中，Glu 的作用最為顯著。

圖1 添加Cat、Glu 和Gly 對稻草腐解進程TOC 含量的影響

2.2 對稻草腐解進程可提取腐殖酸碳（CHE）含量及HE堿溶液△logK 的影響

如圖2 所示，在整個培養過程中，不同處理的CHE含量呈現不同的變化規律，Cat 處理的CHE含量隨培養時間延長而逐漸升高，而Glu、Gly 處理和CK 的CHE則表現為先升高后下降。與0 d 相比，培養結束時（90 d），Cat、Glu、Gly 處 理 和CK 的CHE含 量 分 別 增 加 了475.4%、456.8%、397.5%和386.5%，Cat 處理CHE的增幅最大，其次為Glu 處理。

圖2 添加Cat、Glu 和Gly 對稻草腐解進程CHE 含量的影響

如圖3 所示，隨著培養時間延長，各處理HE 堿溶液△lgK 均表現為漸趨降低趨勢，其中添加Maillard 反應前體物質的3 個處理歷經45 d 和90 d 的培養結果無顯著差異，更有利于培養中后期HE 分子結構的穩定。與0 d 相比，培養結束時（90 d）Cat、Glu、Gly 處理和CK 的HE 堿溶液△lgK 分別降低10.0%、12.9%、30.2%和19.1%，降幅最大的是Gly 處理，即添加Gly 更有利于提升稻草腐解后HE 分子的復雜化。

圖3 添加Cat、Glu 和Gly 對稻草腐解進程HE 堿溶液△lgK的影響

2.3 對稻草腐解進程胡敏酸碳（CHA）含量的影響

如圖4 所示，隨培養時間延長，除了Gly 處理使稻草腐解進程CHA先增加后略有降低外，其余各處理的CHA含量均逐漸升高。與0 d 相比，在培養結束時（90 d），Cat、Glu、Gly 處 理 和CK 的CHA含 量 分 別 增 加 了461.4%、657.1%、493.8%、281.8%，相比CK，添加3 種Maillard 反應前體物質均使CHA含量不同程度提升，其中，添加Glu 增幅最大。

圖4 添加Cat、Glu 和Gly 對稻草腐解進程CHA 含量的影響

2.4 對稻草腐解進程CHA/CFA 的影響

作為評價腐殖質品質的重要指標，CHA/CFA值越大表明腐殖質品質越好。由圖5 可見，隨培養時間延長，各處理和CK 的CHA/CFA均表現為漸趨增高趨勢。與0 d相比，培養結束時（90 d），Cat、Glu、Gly 處理和CK 的CHA/CFA分別增加151.6%、412.4%、312.4%和87.0%。可見，添加3 種Maillard 反應前體物質均能使CHA/CFA獲得比CK 更大幅度的提升，相比之下，添加Glu 在改善腐殖質品質方面更有優勢。

圖5 添加Cat、Glu 和Gly 對稻草腐解進程CHA/CFA 的影響

3 討論

在本試驗條件下，無論是否添加Maillard 反應前體物質，稻草腐解過程均伴隨著礦化的進行，TOC 含量漸趨降低。添加Cat、Glu 和Gly 促進了微生物對稻草的礦化分解，使TOC 含量下降幅度顯著高于CK，添加Glu 降幅最大，下降了22.9%。Glu 和Gly 均為水溶性物質，前者為分子量較小的醛糖，空間位阻小，被視作HS 形成的主要貢獻者[4]，而后者為結構簡單的小分子氨基酸，既能作為微生物的氮源，又能成為不穩定的碳底物[3]，被微生物直接利用并合成自身生命體的能源物質。兩者均能有效提高微生物多樣性，促進微生物對稻草的礦化作用。Cat 是一種強還原劑，易被氧化成鄰苯醌，屬芳香族化合物，化學性質較穩定，微生物利用難度大于Glu 和Gly，但與稻草中的木質素相比，Cat 也可在一定程度上充當能源物質供微生物利用。劉娜等[9]研究指出，特定菌株在2 d 內對濃度低于700 mg/L Cat的降解率可高達90%，微生物通過酶催化、酶促反應和三羧酸循環，最終使Cat 降解為H2O 和CO2[10]。可見，外源添加的3 種Maillard 反應前體物質均可作為底物提升微生物活性，促進微生物對稻草的礦化作用。

HE 是堆肥過程產生的次生產物[11]，CHE含量可作為堆肥腐熟度評價及其農用效果的重要指標。與0 d相比，培養結束時（90 d），Cat、Glu、Gly 處理和CK 的CHE含量分別增加475.4%、456.8%、397.5%和386.5%。可見，與CK 相比，外源添加3 種Maillard 反應前體物質均可顯著提高CHE含量。木質素-蛋白質理論和多酚-蛋白質理論涉及多酚和氨基酸之間的縮聚反應，是自然界中重要的腐殖化途徑[4]，是鄰苯二酚和甘氨酸能夠對HE 形成有促進作用的重要依據。此外，微生物借助外部添加的鄰苯二酚、葡萄糖和甘氨酸來腐解稻草，礦化作用的加劇使更多的稻草分解產物（芳香碳、羧基碳及羰基碳）被釋放，為提升腐殖化作用創造了物質條件。Cat 屬酚類物質，在多酚-蛋白質理論中，酚類是構成腐殖質分子核的關鍵成分[12]，促進生成HE。Glu 和Gly 是腐殖化作用的重要前體物質，且本身可以被微生物利用，最終以菌體的形式進入HE 使CHE含量升高。HE 堿溶液的色調系數（△lgK）可反映其分子的復雜程度，該值越大表明HE 分子結構越簡單[13]。結合HE 堿溶液△lgK 的降低可以判斷，不論是否添加Maillard 反應前體物質，稻草經腐解后HE 分子結構都更加復雜，盡管如此，添加Glu 和Cat 對稻草腐解過程HE 分子結構的復雜化程度不如CK，分析原因如下：微生物利用Glu 可使菌體中多糖含量增多、飽和度增高，同時合成了更多長鏈脂肪烴和不飽和碳鏈[14]，上述物質進入HE組分使其分子結構復雜程度低于CK；Cat 具有一定的生物毒性和強還原性，一定程度上不利于稻草木質素的氧化降解，干擾了微生物代謝[15]，限制了一部分芳香族產物進入HE，故而使HE 分子結構的復雜化程度低于CK，甚至有報道指出，Maillard 反應還解釋了在多糖、還原糖和氨基酸參與，而多酚缺失的環境中仍然有HS 形成的現象[5]。Gly 的添加使培養體系過氧化氫酶活性增加[3]，提高了微生物對稻草木質素的氧化降解[16]，因此使HE 分子結構復雜程度顯著高于CK。

HA 作為腐殖質中的活躍物質[17]，具有疏松多孔的網狀結構，富含羧基、羥基、甲氧基和氨基[18]。在本試驗中，無論添加Maillard 反應前體物質與否，經培養后稻草CHA含量均不同程度提高，其中3 種Maillard 反應前體物質處理下的CHA含量的增幅高于CK。分析其原因如下：Maillard 反應前體物質的添加可極大提高微生物對稻草降解后的腐殖化作用，使縮合產物進入HA 組分，進而使CHA含量提升幅度高于CK，其中Glu 的促進作用最為顯著。在稻草腐解過程，為了充分表征腐殖質品質的變化，用CHA/CFA來描述HA 與FA 間轉化的相對速度[7]。添加3 種Maillard 反應前體物質及CK 處理下的FA 的形成速率小于HA，總體表現為FA 逐漸向HA 轉化。可判斷，稻草完成腐解后，無論是否添加Maillard 反應前體物質，腐殖質品質均獲不同程度提高，與STEVENSON[19]報道一致，即前體物質參與HS 的形成可增加其芳香性，使稻草腐解后的腐殖質品質顯著高于CK，其中添加Glu 在改善腐殖質品質方面更有優勢。

4 結論

隨著培養時間延長，Cat、Glu、Gly 處理和CK 的TOC 含量均呈漸趨降低趨勢，添加3 種Maillard 反應底物對TOC 礦化作用均有所促進，其中，Glu 的作用最為顯著，使TOC 含量下降22.9%；歷經培養，各處理均有利于CHE的增加并促進HE 分子結構復雜化，Cat 的添加使CHE獲得最大幅度提高（475.4%），其次為Glu，Gly 的添加使HE 分子復雜程度達到最高；添加3 種Maillard 反應前體物質能夠使CHA含量獲得提高且改善腐殖質品質，相比之下，Glu 在提高CHA含量及改善腐殖質品質方面更勝一籌。綜上，Glu 在促進稻草礦化分解、提升稻草腐解進程CHA含量、改善腐殖質品質方面更有優勢，Cat 更有利于CHE含量的提升，而Gly 則更易促進HE 分子結構的復雜化。