16 種殺菌劑對(duì)3 種水稻病原細(xì)菌的室內(nèi)抑菌效果研究

侯雨萱 于林 李陽 諶江華

（1 中國(guó)水稻研究所/水稻生物育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311400；2 麗水市土肥植保能源總站，浙江 麗水323000；3 寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040；*第一/通信作者：houyuxuan@caas.cn）

植物病原細(xì)菌是一類重要的病原微生物，包含假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、歐文氏菌屬（Erwinia）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、泛菌屬（Pantoea）和腸桿菌屬（Enterobacter）等20 多個(gè)屬，造成我國(guó)糧食和經(jīng)濟(jì)作物上約70 種細(xì)菌性病害的發(fā)生流行[1]。

黃單胞菌屬代表種稻黃單胞桿菌致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）引起的白葉枯病是危害水稻的世界性重要病害，引起水稻葉片產(chǎn)生黃褐色或白色病斑，影響植物光合作用，一般造成水稻減產(chǎn)10%~30%，重則減產(chǎn)50%以上，甚至絕收[2]。20 世紀(jì)70—90年代，我國(guó)除了新疆、西藏等地未見報(bào)道，白葉枯病在全國(guó)其余各水稻產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和流行，成為危害我國(guó)水稻生產(chǎn)的三大流行性病害之一[3]。

菠蘿泛菌屬于泛菌屬（Pantoea ananatis），早期研究認(rèn)為，菠蘿泛菌是一種植物內(nèi)生菌或者腐生細(xì)菌，但近些年的研究表明，菠蘿泛菌是一種非常重要的植物病原細(xì)菌，可以侵染菠蘿、洋蔥、哈密瓜、杏鮑菇、桉樹、小麥、玉米和水稻等多種單子葉和雙子葉植物，造成葉片和莖稈產(chǎn)生病斑、枯萎、果實(shí)腐爛等多種病癥，引發(fā)新型病害的流行[4-14]。特別在水稻上，是一種新上升的可引起水稻嚴(yán)重病癥的病原菌，在中國(guó)、日本、韓國(guó)、印度、泰國(guó)、馬來西亞、俄羅斯、意大利、土耳其、澳大利亞、貝寧、多哥都有菠蘿泛菌侵染水稻造成危害的報(bào)道，其主要使水稻葉片產(chǎn)生病斑、枯萎、莖壞死、鞘腐爛、內(nèi)稃褐變和谷粒變色等癥狀[15-16]。

阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）屬于腸桿菌屬，廣泛分布于水、土壤和食物上，可以與茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）一起引發(fā)生姜青枯?。贿€可侵染桑樹，使其葉片失水凋萎枯焦，直至脫落，剝開主干層可見木質(zhì)部褐色條狀斑[17-18]。最近XUE 等[19]報(bào)道，阿氏腸桿菌和菠蘿泛菌也會(huì)侵染水稻，造成水稻葉片產(chǎn)生白葉枯病類似癥狀。

3 種病原細(xì)菌都可引起水稻葉部病害，稻黃單胞桿菌致病變種引起的白葉枯病老病新發(fā)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，位于長(zhǎng)江中下游的寧波市自2018 年起白葉枯病發(fā)生面積逐年增加，2021 年達(dá)到4 334.7 hm2次，感病品種包括甬秈15、中早39、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)15、甬優(yōu)538、寧84和寧88 等當(dāng)?shù)刂髟云贩N[20]，原有抗病品種對(duì)新流行菌株抗性喪失，化學(xué)藥劑防治仍是當(dāng)前防治的首要措施。由菠蘿泛菌和阿氏腸桿菌引起的新發(fā)病害，沒有抗性品種資源基礎(chǔ)，篩選適宜的化學(xué)防治藥劑成當(dāng)務(wù)之急。目前登記的防治白葉枯病的常規(guī)藥劑主要有銅制劑、有機(jī)磷、有機(jī)氮、苯基酰胺磷，及噻唑類等雜環(huán)化合物和農(nóng)用抗生素等，但這些藥劑對(duì)白葉枯病的新流行株以及新發(fā)的病原菌是否有效還未可知。為了有效防治水稻葉部的細(xì)菌性病害，作者收集了16 種市售的防治細(xì)菌性病害殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)抑菌活性測(cè)定和評(píng)價(jià)，以期篩選出同時(shí)針對(duì)上述3 種病原細(xì)菌的高效殺菌劑，為水稻新發(fā)的細(xì)菌性病害精準(zhǔn)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑

40%鏈霉素可濕性粉劑，華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司；80%乙蒜素乳油，河南比賽爾農(nóng)業(yè)科技有限公司；3%中生菌素可濕性粉劑，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司；35%喹啉銅四霉素懸浮劑，青島奧迪斯生物科技有限公司；6%春雷霉素可濕性粉劑，江門市植保有限公司；40%春雷噻唑鋅懸浮劑，浙江新農(nóng)化工股份有限公司；20%噻唑鋅懸浮劑，浙江新農(nóng)化工股份有限公司；20%噻菌銅懸浮劑，浙江龍灣化工有限公司；20%噻森銅懸浮劑，浙江東風(fēng)化工有限公司；23%松脂酸銅乳油，山東禾宜生物科技有限公司；70%丙森鋅可濕性粉劑，拜耳集團(tuán)；50%氯溴異氰尿酸可溶性粉劑，江蘇東寶農(nóng)化股份有限公司；20%葉枯唑可濕性粉劑，陜西上格之路生物科技有限公司；8%寧南霉素水劑，德強(qiáng)生物股份有限公司；50%咯菌腈可濕性粉劑，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；16%多抗霉素可溶性粒劑，乳山韓威生物科技有限公司。

1.1.2 供試菌株

2021 年分別于浙江富陽、紹興和杭州種植的水稻品種甬優(yōu)1540 上具有褐色病斑、萎蔫、卷縮等癥狀的病葉中分離鑒定的稻黃單胞桿菌致病變種FY517、菠蘿泛菌SX1 和阿氏腸桿菌HZ27。經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，F(xiàn)Y517 室內(nèi)剪葉接種、SX1 和HZ27 室內(nèi)刮擦后噴霧接種甬優(yōu)1540，14 d 后均能產(chǎn)生不同程度的褐色病斑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 制備含有病原菌的PSA 平板

取-80 ℃貯存的FY517、SX1 和HZ27 菌液，分別在NA 平板上（聚蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉浸膏3 g，蔗糖15 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0）劃線，28 ℃培養(yǎng)48~72 h；挑取單克隆至100 mL M210 液體培養(yǎng)基（酵母提取物4 g，酵水解干酪素8 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0）于28 ℃、200 rpm 條件下培養(yǎng)至OD600值約到1.0。準(zhǔn)備60 mL PSA 液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，L-谷氨酸1 g，蔗糖10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0），加入1%瓊脂糖高溫高壓滅菌，冷至50 ℃，加入6 mL 上述制備的病原菌菌液（OD600=1.0），快速均勻混合后倒于平板，每板約15 mL。

1.2.2 制備不同濃度的藥劑

將各殺菌劑配制成有效濃度為10 000 mg/L，作為原液，分別在無菌1.5 mL 離心管中用水稀釋成10X、100X 和1 000X 液。

1.2.3 測(cè)試抑菌活性

分別取5 μL 殺菌劑的系列稀釋液，在超凈工作臺(tái)中慢慢點(diǎn)到高溫高壓滅菌過濾紙圓片上，吹干，轉(zhuǎn)移至含有病原菌的PSA 平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察病原菌在PSA 平板中的生長(zhǎng)和測(cè)量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 16 種殺菌劑對(duì)3 種病原細(xì)菌的抑菌活性測(cè)定

本研究采用抑菌圈法測(cè)定16 種殺菌劑對(duì)水稻上的3 種病原細(xì)菌稻黃單胞桿菌致病變種FY517、菠蘿泛菌SX1 和阿氏腸桿菌HZ27 的敏感性。結(jié)果（表1）表明，除了8%寧南霉素、50%咯菌腈和16%多抗霉素，其余13 種農(nóng)藥對(duì)FY517 都有不同程度的抑菌作用，抑菌圈直徑在6.1~22.2 mm 之間，抑菌效果最好的是80%乙蒜素，其次是3%中生菌素，最差的是50%氯溴異氰尿酸和20%葉枯唑；常用的白葉枯防治藥劑40%春雷噻唑鋅、20%噻唑鋅、20%噻菌銅和20%噻森銅等在離體條件下的抑菌效果不佳，抑菌圈小于10.0 mm。40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素、6%春雷霉素、50%氯溴異氰尿酸和70%丙森鋅這7 種殺菌劑對(duì)SX1 有不同程度的抑菌效果，抑菌圈直徑在6.8~27.8 mm 之間，抑菌效果最好的是40%鏈霉素，其次是80%乙蒜素，最差的是70%丙森鋅。40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素這5 種殺菌劑對(duì)HZ27 有抑菌作用，且效果依次降低，最高為40%鏈霉素，抑菌圈直徑為24.2 mm，最差為35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素，抑菌圈直徑只有6.2 mm。

表1 16 種殺菌劑對(duì)水稻上3 種病原細(xì)菌的室內(nèi)抑菌效果

所有殺菌劑隨著藥劑的稀釋抑菌效果降低，40%鏈霉素有效作用濃度最低，在原液稀釋100 倍后仍對(duì)SX1 和HZ27 有抑菌效果；其次是80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素，原液稀釋10倍后對(duì)3 菌均有抑制作用；清水對(duì)照抑菌圈直徑為0，沒有抑菌作用（表1）。

2.2 對(duì)3 病原細(xì)菌均起抑制作用的5 種殺菌劑抑菌效果比較

從16 種殺菌劑對(duì)3 菌的抑菌試驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，只有40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素等5 種殺菌劑對(duì)3 細(xì)菌菌株都有抑菌作用，且抑制作用隨著藥劑的稀釋逐漸降低（圖1）。當(dāng)殺菌劑濃度為原液（10 000 mg/L）時(shí)，40%鏈霉素對(duì)SX1 的抑制作用最強(qiáng)，HZ27 次之，F(xiàn)Y517 相對(duì)較差；80%乙蒜素對(duì)SX1 的抑制作用最強(qiáng)，F(xiàn)Y517 次之，HZ27相對(duì)較差；3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素對(duì)FY517 的抑制作用最強(qiáng)，SX1 次之，HZ27 相對(duì)較差（圖2A）；當(dāng)殺菌劑在原液的基礎(chǔ)上稀釋10 倍時(shí)，40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素4 種殺菌劑對(duì)3 種菌株同時(shí)均有抑制作用，且作用趨勢(shì)與相應(yīng)原液基本一致（圖2B）。

圖1 5 種抗生素類藥劑對(duì)3 種病原細(xì)菌形成的抑菌圈

圖2 5 種抗生素類藥劑對(duì)3 種病原細(xì)菌的抑菌活性比較

從數(shù)據(jù)分析結(jié)果來看，在離體平板上單獨(dú)抑制稻黃單胞桿菌致病變種FY517，首推80%乙蒜素，其次是40%鏈霉素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素，20%噻唑鋅和20%噻菌銅等金屬類制劑有一定抑制作用，但效果沒有前二者強(qiáng)；單獨(dú)抑制SX1 和HZ27，首推40%鏈霉素，其次是80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素。

對(duì)于這3 種新出現(xiàn)的水稻細(xì)菌性病害的流行株，室內(nèi)的16 種殺菌抑菌活性試驗(yàn)表明，抗生素類藥劑的離體平板抑菌效果較好，且對(duì)3 種菌株同時(shí)有抑菌作用，鑒于40%鏈霉素已在大田防治中禁用，作者建議在大田同時(shí)防治3 種新發(fā)病害時(shí)可以使用80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素。

3 討論

近年由于氣候環(huán)境和耕作制度的變化以及病原菌生理小種的不斷變異，水稻白葉枯病在浙江等省份又開始大面積流行，菠蘿泛菌和阿氏腸桿菌引起的新病害也突現(xiàn)，這3 種病原細(xì)菌都能致水稻葉部產(chǎn)生病斑、萎縮、枯萎，影響光合作用，降低水稻產(chǎn)量。本研究針對(duì)這一突現(xiàn)緊急生產(chǎn)問題，進(jìn)行了市售16 種殺菌劑對(duì)3種病原細(xì)菌菌株的離體抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素這5 種抗生素類殺菌劑同時(shí)對(duì)3 種病原細(xì)菌菌株具有顯著抑菌作用，80%乙蒜素對(duì)稻黃單胞桿菌致病變種FY517 的抑菌效果最佳，40%鏈霉素對(duì)SX1 和HZ27 抑菌效果最佳。

40%春雷噻唑鋅、20%噻唑鋅和20%噻菌銅等金屬類制劑對(duì)稻黃單胞桿菌致病變種引起的白葉枯病田間防效好，防治效果可以達(dá)到69.6%~90.7%[21-22]。但在我們的室內(nèi)試驗(yàn)中，以上3 種殺菌劑對(duì)稻黃單胞桿菌致病變種新流行株FY517 有一定程度的抑制作用，能形成抑菌圈，但抑菌圈直徑顯著小于40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素等5 種抗生素類殺菌劑形成的抑菌圈。余山紅等[23]也證實(shí)，噻唑鋅、噻森銅和噻菌銅對(duì)近期從浙江臨海分離的白葉枯病新流行菌株室內(nèi)抑菌效果不佳，丙硫唑和中生菌素等的室內(nèi)抑菌效果好。這兩項(xiàng)研究中使用的供試菌株均為新分離的流行菌株，噻唑鋅等對(duì)其室內(nèi)抑菌效果不佳，可能是由于噻唑鋅等的大量使用，新流行菌株產(chǎn)生部分抗性；亦或是新流行菌株的變異導(dǎo)致原有金屬類制劑的抑菌活性正在逐步降低。

在我們的試驗(yàn)中篩選到3%中生菌素、80%乙蒜素等5 種抗生素對(duì)菠蘿泛菌有顯著的抑菌作用。王大會(huì)等[24]報(bào)道，1.6%噻霉酮、3%中生菌素和80%乙蒜素對(duì)煙草葉枯病的致病菌成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）有較好的抑菌效果，抑制中濃度值分別4.0、13.5 和117.6 μg/mL，綜合來看，3%中生菌素和80%乙蒜素對(duì)泛菌有顯著抑菌效果，可以作為防治藥劑。另外也有報(bào)道，Bacillus licheniformis產(chǎn)生的抗菌肽A 通過阻礙菠蘿泛菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成來抑制其生長(zhǎng)[25]。這表明我們可以進(jìn)一步篩選生防菌來精準(zhǔn)綠色防治菠蘿泛菌引起的病害。

蒙姣榮等[26]測(cè)定了包括中生菌素在內(nèi)的10 種藥劑對(duì)引起桑樹細(xì)菌性枯萎病的阿氏腸桿菌的藥效，發(fā)現(xiàn)中生菌素抑菌效果最好，最低有效抑制濃度為11.3~15.0 μg/mL；農(nóng)用鏈霉素次之，最低有效抑制濃度為7.5~113.0 μg/mL。而在我們的試驗(yàn)結(jié)果中對(duì)阿氏腸桿菌抑菌效果最好的是40%鏈霉素，其次是80%乙蒜素和3%中生菌素，導(dǎo)致這個(gè)抑菌效果的差異可能是由于供試菌株來源于不同寄主的不同株系。

后續(xù)作者將以同時(shí)對(duì)3 種病原細(xì)菌具有顯著抑菌作用的40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素為供試藥劑，進(jìn)行溫室盆栽和田間小區(qū)試驗(yàn)，以明確這幾種藥劑的田間實(shí)際防治效果，為精準(zhǔn)防治水稻細(xì)菌性葉部病害提供參考和指導(dǎo)。