不同劑量率輻射對水稻誘變效應的影響

陸艷婷，楊文新，劉超綱，俞法明，葉靖，陳金躍，王炳奎

(浙江省農業科學院 作物與核技術利用研究所，浙江 杭州 310021)

電離輻射能量可使生物體各種分子發生電離和激發，這些分子通過一系列反應產生活潑的自由原子和自由基，再與大分子物質如核酸、蛋白質和酶等發生反應，引起分子結構的變化，導致生物體正常生化過程受到干擾，引發DNA堿基改變、各種細胞器的結構及其組成變化，產生基因突變，從而產生新的性狀或變異體。γ射線具有波長短、頻率高、能量高的特點，穿透力強，可使生物體內細胞發生電離作用。

水稻的種植面積和產量分別占世界作物生產的1/5和1/4，是重要的糧食作物。好的品種對于水稻生產十分重要，種質資源是水稻育種的關鍵，有效地開發和利用水稻種質資源，才有可能取得品種的遺傳改良和育種的突破。近年來審定的品種較多，但同類型品種間的遺傳距離狹窄、遺傳差異相對較小[1-4]，成為水稻育種難以取得突破性進展的原因之一。輻射誘發突變創制新種質是解決這些問題的重要途徑之一。不同劑量的60Co-γ射線、重離子、UV-C等對農作物的誘變效應已有報道[5-9]，但至今未見137Cs-γ射線的不同劑量率輻射對水稻誘變效應影響的相關報道。本試驗以水稻種子為材料，開展了137Cs-γ射線的不同劑量率和不同劑量的輻射處理，以了解水稻種子對不同劑量率和不同劑量137Cs-γ射線輻射的敏感性和生理響應，探究不同劑量率和不同劑量對水稻誘變效應的影響，為水稻輻射誘變中提高有效誘變率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用的水稻品種為秈型水稻浙1613和粳型水稻浙粳100，秈型水稻浙1613種子含水量小于13.5%，粳型水稻浙粳100種子含水量小于14.5%，符合國家貯藏標準。

1.2 輻射劑量率與劑量設計

輻射處理在浙江省農業科學院國家水稻改良中心輻射育種研究室(浙江省輻照中心)進行，放射源為137Cs；處理劑量率分別為10、60、250 Gy·h-1；劑量分別為150、250、350、400、450 Gy。用于測序的400 Gy不同劑量率各處理的種子量為100 g，其他各處理種子50 g，以無輻射處理(即0 Gy)為對照，劑量計與樣品并排排列，3次重復。

1.3 發芽試驗

試驗于2021—2022年在浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所核技術利用研究室進行。取12 cm×12 cm實驗用種子發芽盒，底部放入3張濾紙，加入40 mL純凈水，每處理隨機選取飽滿的100粒水稻種子均勻放至各發芽盒中，種子之間保持足夠的距離，以保證種子都能充分接觸水分，吸水一致，生長良好，每處理設3次重復，隨機排列。在實驗過程中隨時檢查，保持濾紙濕潤。發芽盒放入植物生長箱(型號：Binder KBW400；德國賓德有限責任公司)培養，設定溫度(30±2)℃。2 d時將已萌發(可見芽和根)的種子轉入96孔水培盒。培養液濃度為463.9 mg·L-1的Yoshida水稻營養液(干粉)，pH值為5.8±0.1，水培盒每5 d更換1次營養液。

1.4 成苗率與苗高

7 d時統計發芽率，21 d時統計成苗率。只長芽不發根或只發根不長芽的種子剔除。從每個種植箱內隨機選取除四周位置外的10株幼苗跟蹤測量7、21 d時苗高、根長，并計數21 d的總根數。

1.5 基因測序

各取不同劑量率的400 Gy輻射處理的2 000株7 d時的幼苗等量葉片混合提取DNA，以不輻照為對照，委托北京諾禾致源科技股份有限公司測序。DNA樣品經電泳檢測后通過Covaris破碎機隨機打斷為長度為350 bp的片段，構建的文庫通過illumina HiSeqTMPE150進行測序。3個不同劑量率處理及對照測序平均深度在(36.21～39.39)×，為了保證數據質量，對測序得到的原始序列中含有帶接頭的、低質量的信息進行過濾，然后將過濾后的有效測序數據比對到R498參考基因組(http：//mbkbase.org)，比對結果去重復后進行統計分析。

1.6 數據分析

用SPSS和Excel軟件進行所有數據的統計分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 輻射劑量測量

對輻射的實際劑量進行測定，不同劑量率下不同預設劑量的實測標準差在1.6～4.4 Gy，符合試驗要求(表1)。

表1 輻照處理的劑量測定

2.2 不同劑量率輻射對水稻發芽率和成苗率的影響

由表2可見，不同輻射劑量處理對供試材料的發芽率和成苗率有明顯影響，隨著輻射劑量的增加，浙1613和浙粳100的種子發芽率和成苗率均下降。同一劑量處理下，不同劑量率輻射對浙1613的7 d發芽率沒有顯著影響；浙粳100在350、450 Gy輻射劑量處理時，不同劑量率下發芽率有顯著差異。250、350、450 Gy輻射劑量處理下，浙粳100的21 d成苗率有顯著差異。結果表明，較低劑量下不同劑量率輻射對成苗率沒有影響，但較高劑量處理時不同劑量率對成苗率有顯著影響。

表2 不同劑量率輻照對水稻成苗率的影響

2.3 不同劑量率輻射對水稻幼苗苗高的影響

對2個水稻品種在不同輻射條件處理后的苗高進行測量，發現輻射處理抑制幼苗生長，且隨劑量增大抑制更加明顯(圖1)。浙1613經10、60、250 Gy·h-1不同劑量率下的350 Gy輻射處理的21 d苗高分別為14.6、15.2、15.9 cm，較對照分別降低12.05%、8.43%、4.22%，10 Gy·h-1的低劑量率處理的苗高顯著低于250 Gy·h-1高劑量率處理的苗高；450 Gy的不同劑量率處理的苗高差異顯著性情況與350 Gy相一致。浙粳100在250、350 Gy輻射條件下，250 Gy·h-1處理的21 d苗高均顯著高于10 Gy·h-1處理，10、60、250 Gy·h-1劑量率的450 Gy輻射處理的21 d苗高分別為4.4、4.7、5.2 cm，較對照分別降低51.11%、47.77%、42.22%，250 Gy·h-1處理的21 d苗高顯著高于10、60 Gy·h-1處理。

同劑量不同劑量率柱子上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可見，不同輻射劑量對水稻根系生長影響顯著。隨著輻射劑量的增加，水稻根長降低，總根數隨之減少，品種間降幅略有差異，輻射處理明顯抑制幼苗的根系生長，且隨輻射劑量增大抑制更加明顯。與苗高的變化趨勢相似，較高輻射劑量處理時，高劑量率的處理根長和根系數均要高于低劑量率的。在450 Gy劑量處理下，浙粳100在高劑量率處理組的根長與根數高于低劑量率處理。

表3 同一劑量不同劑量率輻射對水稻根系生長的影響

2.4 高劑量輻射下不同劑量率對水稻農藝性狀的影響

高劑量輻射處理影響種子苗床成苗率、大田成活率和結實率。如表4所示，10、60、250 Gy·h-1不同劑量率下450 Gy輻射處理對浙1613和浙粳100的苗床成苗率、大田成活率和株高的影響明顯。450 Gy輻射處理下的不同劑量率處理對浙1613的分蘗數、有效穗、穗長影響不明顯，而對浙粳100影響較大。450 Gy高劑量輻射處理明顯降低水稻的實粒數、總粒數和結實率。劑量率越高，浙1613的每穗實粒數下降越顯著，而浙粳100在各劑量率下的影響都特別明顯。浙1613的總粒數在3個不同劑量率下差異不明顯，但浙粳100在3個不同劑量率之間差異較大。不同劑量率對結實率的影響與實粒數相一致。株高是重要的植物形態學指標，較高劑量輻射下水稻受影響較為明顯，3個不同劑量率的水稻成株后株高均下降，且浙粳100受影響較大。

表4 高劑量條件下不同劑量率輻射對水稻生長的影響

2.5 不同劑量率的輻射對基因組誘變程度的影響

3個不同劑量率處理對水稻種子發芽率影響不顯著，但對水稻后期生長造成一定的影響。為評估不同劑量率的輻射對基因組誘發突變程度的影響，對3個不同劑量率400 Gy輻射處理的浙1613全基因組測序，評估發生變異的概率。

通常認為變異位于外顯子區域或剪接位點可能會引起功能變異，根據全基因組InDel和SNP變異檢測結果，10、60、250 Gy·h-1劑量率處理的樣品獲得標記的個數分別為1 140 624個(其中，Indel為174 813個，SNP為965 811個)、1 141 426個(其中，Indel為174 365個，SNP為967 061個)和1 139 980個(其中，Indel為174 292個，SNP為965 688個)。與對照比對發現存在變異的位點分別為75 262個(其中，Indel為27 183個，SNP為48 079個)、77 143個(其中，Indel為27 315個，SNP為49 828個)和81 056個(其中，Indel為28 015個，SNP為53 041個)，其中，位于外顯子區域或可變剪接位點的變異分別為2 869(其中，Indel為514個，SNP為2 355個)、3 010個(其中，Indel為505個、SNP為2 505個)、和3 363個(其中，Indel為540個，SNP為2 823個)，分別占總變異位點的3.81%、3.90%、4.15%，占總位點的0.25%、0.26%、0.30%，即3個不同劑量率處理后可能發生變異的概率分別為0.25%、0.26%、0.30%，表明不同劑量率處理誘發的基因組變異存在差異(圖2)，且隨劑量率的增加而增加。

圖2 不同劑量率處理對水稻幼苗全基因組可能變異的概率估算

3 小結與討論

當前，種業“卡脖子”技術受到黨和國家領導人及學術界的高度重視，也受到浙江省政府以及省內外種業和農學界高度重視[10-11]，如何突破種業“卡脖子”技術，需要在育種技術上積極探索。水稻的自然變異率約二十萬分之一，長期以來的實踐表明，輻射誘變的變異率可達千分之幾，這與本試驗根據全基因測序估算的3個不同劑量率間的可能變異率在0.25%～0.30%相吻合，說明輻射處理可以在相對較短的時間內培育出特異的種質資源，輻射誘變育種是作物育種取得突破的重要途徑之一[1，12-13]，因此，有必要對各種作物種子的輻射誘變效應進行系統研究。

全基因測序可以評估輻射誘導基因組發生變異的概率。林兆松等[13]認為秈稻的半致死劑量為350～450 Gy，因此，本試驗設置400 Gy輻射劑量來開展10、60、250 Gy·h-13個不同劑量率的試驗，以評估在半致死劑量水平上不同劑量率對全基因組發生變異概率的影響。測序結果顯示，不同劑量率對于DNA的堿基插入、缺失等影響未達到顯著水平，但變異概率仍有比較明顯的差異。γ輻照導致的堿基排列差異直接導致基因的改變，從而導致性狀的改變。相同劑量下，較低劑量率處理意味著輻射處理的時間延長，植株成株后株高較低，而高劑量輻射采用低劑量率處理也無明顯的負面效應；高劑量率處理時間短，植株結實率較低，變異率較高。因此，實際操作中可根據實際情況選擇高劑量率或低劑量率。目前，科技部已經推出“主要農作物種質定向誘變技術”重大專項研究。在進行不同劑量對水稻不同品種類型輻射誘變效應研究的基礎上，開展不同劑量率的誘變效應研究，結合基因組學的方法進行評估，可以深入地了解γ射線輻射的誘變效應機理，為輻射誘變提供更多支撐。

本研究表明，137Cs-γ射線對水稻種子具有較強的誘變效應，不同遺傳背景的品種之間對輻射敏感性表現出一定的差異。較高劑量輻射下，低劑量率(10 Gy·h-1)的處理，對浙1613和浙粳100水稻種子的成苗率影響顯著；350 Gy和450Gy較高劑量處理，劑量率為250 Gy·h-1的浙1613和浙粳100苗高均高于10和60 Gy·h-1處理；450 Gy輻射劑量處理下，60和250 Gy·h-1處理的浙粳100根長與根數高于10 Gy·h-1處理。較高劑量下，低劑量率處理對2個品種的株高影響更明顯，但高劑量率對結實率影響更大。全基因測序評估可能變異率結果顯示，不同劑量率處理誘發的基因組變異存在差異，且隨劑量率增加而增加。

總之，在較高劑量輻射處理后，低劑量率與高劑量率間的輻射效應差異較大。結合形態學與基因組學研究，發現較高劑量輻射下，低劑量率處理水稻成株后株高下降，高劑量率處理結實率大幅下降，變異概率增加。這些結果對于進一步提升水稻輻射誘變育種技術，為新品種的繁育提供更為豐富的突變材料具有積極的意義。