副豬嗜血桿菌凍干保護劑試驗研究

張小蘭 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是革蘭氏陰性多形態細菌， 是存在于豬上呼吸道的一種共棲菌[1]，該菌主要引起豬的纖維素性多發性漿膜炎、腦膜炎和關節炎等為特征的副豬嗜血桿菌病，也稱格拉瑟病（Glasser′s diseas）[2]。 該病是影響全球養豬業最為嚴重的細菌性疾病之一， 給養豬行業帶來巨大的經濟損失， 疫苗免疫是預防和治療該病的主要方法。菌種保藏是保證疫苗品質的關鍵因素，保藏是否得當直接影響菌種活性，影響菌液高密度發酵。冷凍真空干燥法是保藏微生物的主要方法之一，在冷凍干燥時添加適當的保護劑， 對減少微生物在冷凍干燥及長期保藏過程中的死亡和變異起著至關重要的作用[3]。 但每種微生物對添加的保護劑種類、濃度和配比等有不同需求， 需要試驗摸索才能得到最佳凍干效果。 目前對于副豬嗜血桿菌凍干保護劑研究的報道相對較少， 本試驗從牛乳蔗糖和明膠蔗糖2 種常規凍干保護劑著手， 設計6 組保護劑與菌液不同凍干配比進行試驗， 篩選1 組最佳的凍干保護劑及配比， 再進行6 次不同血清型菌株的凍干驗證以及菌種-20 ℃保存1 年、2 年、3 年活菌數變化試驗，最終通過凍干的物理性狀、菌種存活率、復蘇情況、菌種保存條件和時間對活菌數影響等指標，考察凍干效果， 確定一種適合副豬嗜血桿菌菌種凍干的保護劑配方。

1 材料與方法

1.1 菌種 副豬嗜血桿菌4 型H25 株、5 型H45 株和12 型H31 株， 由廣東省農業科學院動物衛生研究所鑒定，兆豐華生物科技（福州）有限公司實驗室保存。

1.2 培養基及試劑 胰酪大豆胨固體培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB），購自廣東環凱微生物科技有限公司；酵母粉，購自OXOID 公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），購自廣州美津生物技術有限公司；牛血清，購自山西潤生大業生物材料有限公司。

1.3 儀器 TS-2102C 恒溫搖床， 購自上海捷呈實驗儀器有限公司；全自動真空冷凍干燥機，購自楚天科技股份有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 HPS 菌液制備 將凍干副豬嗜血桿菌4 型H25 株、5 型H45 株和12 型H31 株分別用TSB 液體培養基（10%牛血清，16 μg/mL NAD，下同）溶解后， 接種TSA 固體培養基 （10%牛血清，16 μg/mL NAD， 下同） 平板上，37 ℃靜置培養24 h， 連續傳2 代。 挑取典型單菌落接種5 mL TSB 液體培養基，37 ℃、200 r/min 振蕩培養8～10 h，取新鮮培養菌液，按1∶50 比例接種TSB 液體培養基， 擴大培養8～10 h，收集菌液，作為凍干菌液備用。

1.4.2 牛乳蔗糖保護劑制備 稱取5 g 蔗糖、10 g脫脂乳粉置于玻璃瓶中攪拌、溶解，注射用水定容至100 mL，116 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后置2～8 ℃保存備用。

1.4.3 明膠蔗糖保護劑制備 稱取8 g 明膠， 用水浴加熱法將明膠攪拌溶解完全， 再稱取、 加入40 g蔗糖充分攪拌溶解， 注射用水定容至100 mL，116 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后置37 ℃保存備用。

1.4.4 活菌計數 按照 《中華人民共和國獸藥典》（2020 版）三部附錄3405 中的表面培養測定法進行活菌計數。

1.4.5 真空冷凍干燥 試驗樣品入箱。 凍干曲線設定：-42 ℃預凍3 h；7 ℃一次升華，18 pa 運行8 h；28 ℃二次升華，0.5 pa 運行3 h。

1.5 凍干存活率計算 凍干存活率=凍干后樣品活菌總數/凍干前樣品活菌總數×100%。

1.6 凍干試驗 將制備好的4 型H25 株HPS 菌液、 牛乳蔗糖保護劑和明膠蔗糖保護劑按表1 配方進行試驗， 凍干后每瓶進行物理性狀檢查， 抽樣計數，加入TSB 恢復凍干前體積，測定凍干菌種存活率和菌種復蘇情況。

表1 凍干試驗分組

1.7 凍干試驗驗證 在凍干試驗的基礎上，篩選最佳的菌液與保護劑配方， 分別用4 型H25 株、5 型H45 株和12 型H31 株菌液進行凍干驗證， 每個菌株驗證2 次，觀察凍干后的物理性狀，測定凍干存活率、菌種復蘇情況。

1.8 保存條件及時間 將凍干菌種置于-20 ℃冰柜保存， 并于保存后的1 年、2 年、3 年進行活菌計數，繪制曲線，觀察活菌數變化情況、菌種復蘇情況。

2 結果與分析

2.1 凍干試驗 4 型H25 株菌液與凍干保護劑按不同比例混合，凍干結果見表2。 從物理性狀檢查來看，只有試驗4 組和試驗5 組的物理性狀合格，凍干后呈海綿狀、疏松、微黃色、遇水速溶。 從存活率來看，試驗4 組的存活率為64.2%，試驗5 組的存活率為70.4%，試驗5 組的存活率高于試驗4 組，且試驗5 組菌種復蘇情況正常。 綜上三點因素，篩選出試驗5 組即牛乳蔗糖保護劑與菌液為2∶1 的比例作為最佳保護劑配方。

表2 凍干保護劑與菌液不同配比凍干試驗結果

2.2 凍干驗證 用試驗5 組配方即牛乳蔗糖保護劑與菌液為2∶1 的比例進行6 次不同血清型菌株的凍干驗證試驗。 從表3 可以看出，無論是HPS 4 型H25 株、5 型H45 株還是12 型H31 株，其凍干的物理性狀均合格，復蘇后的菌體形態、長勢均正常，存活率達72.2%及以上。從數據結果來看，不同菌株的存活率不一樣， 菌株存活率由高到地依序為12 型H31 株、5 型H45 株、4 型H25 株。

表3 不同菌株凍干驗證結果

2.3 保存條件及時間 HPS 4 型H25 株、5 型H45株和12 型H31 株凍干菌于-20 ℃冰柜保存，分別在保存1 d、1 年、2 年、3 年取樣計數，觀察細菌復蘇情況，結果見表4。 三種菌株在-20 ℃保存1 d、1 年、2年和3 年分別復蘇，菌體形態、長勢均正常，菌種活力未受影響。 三種菌株活菌數隨著保存時間延長呈緩慢下降趨勢，但活菌滴度仍維持在108CFU/mL 以上，符合菌種保存的變化規律。

表4 不同血清型凍干菌-20 ℃保存不同時間活力測定結果

3 小結與討論

研究表明， 采用牛乳蔗糖與菌液為2∶1 的比例凍干HPS，物理性狀最好，存活率達到75%，以此配比再進行6 次凍干驗證（4 型H25 株、5 型H45 株和12 型H31 株各凍干2 次），物理性狀均合格，存活率均不低于72%。 菌種于-20 ℃保存1 年、2 年、3 年，活菌數滴度仍然維持在108CFU/mL 以上，活菌數沒有明顯下降，菌種復蘇后菌體形態、長勢等均正常。因此，采用牛乳蔗糖保護劑與菌液為2∶1 的比例，適合副豬嗜血桿菌凍干。

副豬嗜血桿菌病是嚴重危害養豬業的細菌傳染病之一，隨著國家減抗、禁抗進程加快，副豬嗜血桿菌病的防控采用疫苗免疫越來越普遍。 作為疫苗生產者，菌種制備、保存是疫苗上游制備的關鍵工序。目前大多數菌種長期保存方法是冷凍真空干燥法，其中凍干保護劑的種類、濃度、配比等在凍干過程中起重要作用，對微生物的保存效果都有明顯影響。采用的凍干保護劑不僅要保證制品的良好凍后外觀、溶解度，也要保證菌種的高存活率和穩定性。本試驗篩選出適合副豬嗜血桿菌凍干用保護劑及配比，為副豬嗜血桿菌凍干菌種的制備和保存提供參考。