一株鴨源大腸桿菌噬菌體vB_EcoS214 的分離鑒定

劉 娜 陳紅梅 江南松 黃 瑜 傅光華 程龍飛

（福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心/福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省禽病防治重點實驗室，福州 350013）

禽致病性大腸桿菌是侵害水禽的常見的一種致病菌，其致病類型多種多樣，導致鴨體消瘦、死亡、胴體淘汰等造成巨大的經(jīng)濟損失， 嚴重制約了養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。 抗生素對于禽致病性大腸桿菌感染的治療起到重要的作用，然而在治療過程中，該菌容易產生耐藥問題，在國家限抗、減抗的大背景下，抗生素治療的局限性越來越明顯。 相對于抗生素治療，噬菌體治療法具有樂觀的應用前景，它的特異性強、無明顯副作用等都具有很大的優(yōu)勢[1]。 本項目從鴨場污水中分離到能裂解鴨源大腸桿菌的噬菌體，以期為水禽致病性大腸桿菌病的噬菌體療法提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及配制 麥康凱瓊脂，購自北京陸橋技術有限責任公司；LB 肉湯、瓊脂、氯化鈉、明膠、硫酸鎂等，生工生物工程（上海）股份有限公司產品；SM 緩沖液：取氯化鈉5.8 g、硫酸鎂2 g、明膠0.1 g，加入1 000 mL 雙蒸水中， 高壓滅菌后室溫保存；0.7%半固體LB 瓊脂、LB 肉湯和麥康凱瓊脂平板按常規(guī)方法制備。

1.2 菌株及培養(yǎng)條件 鴨源大腸桿菌21 株， 保存于福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所。取凍干粉，劃線培養(yǎng)于麥康凱平板，37 ℃溫箱中培養(yǎng)16 h， 挑單菌落接種于LB 肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，4 ℃保存。

1.3 樣品的采集與處理 取福建省福州市永泰某成年麻鴨場污水樣品500 mL，8 000×g 離心10 min，上清用450 nm 濾膜過濾。 濾液中加入等體積的2×LB，然后加入大腸桿菌菌液，37 ℃溫箱中放置10 h。8 000×g 離心10 min，用450 nm 濾器過濾上清。 重復增殖1 次濾液， 濾液經(jīng)2 次增殖后放置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 噬菌體分離和純化 取一定量的大腸桿菌菌液與噬菌體原液混勻，37 ℃水浴15 min 后加45 ℃的LB 肉湯（6 g/L），混勻后立即倒入麥康凱平板上，待平板徹底凝固后再將它倒置在37 ℃溫箱中培養(yǎng)6 h 左右，觀察是否出現(xiàn)透明空斑（噬菌斑）。 按文獻方法[2]，挑取單個透亮且清晰的噬菌斑，加入1 mL SM 緩沖液中，吸取上清用450 nm 濾器過濾，得到噬菌體原液。 適當稀釋噬菌體原液后再與大腸桿菌菌液混勻鋪板。 重復上述步驟3～5 次，直到平板上出現(xiàn)的噬菌斑大小均勻、形態(tài)一致為止。

1.5 噬菌體vB_EcoS214 的電鏡觀察 取純化后的噬菌體vB_EcoS214 培養(yǎng)液10 μL 滴加在載膜銅網(wǎng)上，靜置1 min 左右，用濾紙將液體吸干，再加入磷鎢酸（pH 6.8，20 g/L）負染1 min，用濾紙吸干，待自然干燥后，使用日立透射電鏡HT7700 觀察。

1.6 噬菌體vB_EcoS214 的裂解譜測定 將21 株大腸桿菌加入適量的噬菌體， 再與半固體LB 瓊脂混合均勻后立即倒入麥康凱瓊脂，待完全凝固后，置37 ℃培養(yǎng)6～12 h，觀察是否形成噬菌斑。

2 結 果

2.1 噬菌體的分離及純化 以Ef-13 為宿主菌時，可以觀察到透亮的噬菌斑。挑單個噬菌斑，連續(xù)傳代5 次后，獲得純化的噬菌體，命名為vB_EcoS214。 噬菌斑的形態(tài)和大小保持均勻一致，呈圓形、透明，邊緣清晰，直徑約為1 mm，見圖1。

圖1 噬菌體vB_EcoS214 的噬菌斑

2.2 噬菌體vB_EcoS214 的形態(tài) 噬菌體vB_EcoS214 由1 個多面體的頭部和細長的尾部組成，見圖2。 頭部平面輪廓為正六邊形，直徑約為40 nm，尾部長約220 nm、寬約10 nm。 根據(jù)有關噬菌體的分類[3]，vB_EcoS214 屬于長尾噬菌體。

圖2 噬菌體vB_EcoS214 的電鏡照片

2.3 噬菌體vB_EcoS214 的裂解譜 裂解譜測定結果表明： 在復蘇的21 株菌中， 噬菌體vB_EcoS214可以裂解其中4 株大腸桿菌， 裂解率為19.05%，見表1。

表1 噬菌體vB_EcoS214 的裂解譜

3 討 論

噬菌體作為一種綠色天然的 “抗菌藥物”，因其制劑安全性高、 特異性強和研發(fā)周期短等， 有望作為“后抗生素時代”的治療方法[4]。 本研究從鴨場污水樣品中成功分離到1 株能裂解鴨源大腸桿菌的噬菌體，將其命名為vB_EcoS214。電鏡下觀察，該噬菌體由1 個直徑約為40 nm 的頭部和一根長約220 nm 的尾部組成， 全長約260 nm。 根據(jù)有關噬菌體的分類[3]，vB_EcoS214 屬于長尾噬菌體。噬菌體vB_EcoS214 能夠特異性裂解4 株大腸桿菌，裂解率為19.05%，其裂解力略高于趙尊福等[5]所分離的噬菌體Bp16，低于姚瀾等[6]所分離的噬菌體vB_E coS_AH50 及劉暢等[7]所分離的噬菌體VB_EcoMZQ1。 目前噬菌體的裂解譜窄制約了其臨床應用，有學者探索研制噬菌體雞尾酒， 即組合多個噬菌體來拓寬噬菌體裂解譜[8]，以期突破單個噬菌體裂解譜窄的難題。 噬菌體vB_EcoS214 的裂解譜較寬，顯示其具有制備噬菌體雞尾酒的潛力， 該噬菌體生物學特性等還需要進一步深入研究。

4 結 論

本研究成功分離鑒定了一株能裂解鴨源大腸桿菌的噬菌體vB_EcoS214，屬長尾病毒科。 該噬菌體有較寬的裂解譜，裂解力較強，可成為噬菌體雞尾酒制劑的候選噬菌體。該噬菌體的成功分離，為鴨大腸桿菌病的噬菌體療法提供參考。