大黃魚虹彩病毒胞內增殖以及2 個功能蛋白的細胞定位

楊西西 池洪樹 鄭在予 劉曉東 福建省農業科學院生物技術研究所 福州 350003

大黃魚（Larimichthys crocea）是我國養殖量最高的海水魚類，福建是大黃魚的主養區，產量占全國總量的83%[1]。1999 年何愛華等[2]通過從夏季暴發性死亡的大黃魚幼魚中發現虹彩病毒，陳新華等[3]也證明了1999-2001 年夏季福建省寧德、羅源等地養殖大黃魚幼魚暴發性死亡由虹彩病毒感染所致， 將其命名為大黃魚虹彩病毒 （Large yellow croaker iridovirus，LYCIV）， 通過基因組測序證實該病毒為腫大細胞病毒屬虹彩病毒。 腫大細胞病毒屬虹彩病毒可感染超過100 種經濟和觀賞性海水魚、淡水魚，導致患病幼魚病死率可達100%[4]。 腫大細胞病毒屬的典型代表種是20 世紀90 年代末導致中國養殖鱖魚暴發性死亡的病原， 即傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）[5]。 Dong 等[6]建立了對ISKNV 敏感的鱖魚仔魚細胞系 （Mandarin fish fry cell line 1，MFF-1），并制備了多種ISKNV 的蛋白特異性抗體。在前期研究中，本課題組利用MFF-1 細胞系成功從福建福鼎分離培養了大黃魚虹彩病毒FD201807 株， 本研究對該毒株在MFF-1 上的增殖進行定量分析，并利用兩種ISKNV 蛋白的特異性抗體對感染了FD201807株的MFF-1 細胞進行細胞間接免疫熒光試驗，以期了解FD201807 株與ISKNV 是否有共同抗原，并對同源蛋白與細胞結合位點進行定位。

1 材 料

病毒FD201807 株由福建省農業科學院生物技術研究所分離保存；MFF-1、 特異性抗體ISKNVVP023 單克隆抗體和ISKNV-VP101 多克隆抗體由中山大學提供；組織基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；高糖DMEM 培養基，胎牛血清（FBS），含EDTA 和酚紅的胰酶，青霉素和鏈霉素雙抗，均購自美國Gibco 公司；TB GreenPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；Triton X-100 購自廣州威佳生物公司； 即用型正常山羊血清購自武漢博士德生物工程有限公司； 細胞核染料33342、Alexa Fluor 488 羊抗鼠IgG 綠色熒光二抗、Alexa Fluor 555 羊抗兔IgG 紅色熒光二抗均購自美國invitrogen 公司；封片劑Fluoroshield（美國SIGMA 公司）。

2 方 法

2.1 病毒培養 將液氮中保存的1 mL MFF-1 細胞液加至新鮮DMEM 培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的25 cm2細胞培養瓶中，置于5%CO2培養箱內27 ℃培養，飽和濕度。 細胞長至單層鋪滿后，用0.25%胰酶消化、傳代，再長至單層后用于病毒接種。 將保存于-80 ℃冰箱中的FD201807 株細胞培養物凍融3 次，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集上清，按1∶10 接種于新培養的單層MFF-1 細胞，80%細胞出現病變時凍存， 凍融后繼續傳代。

2.2 病毒定量分析 根據FD201807 的MCP 基因序列（Genbank：OQ475017），利用Primer Premier 5.0設計定量PCR 引物，Q-MCP-F：5′-CGGTATCACCAACGGTCAGACTATG-3′；Q-MCP-R：5′-GGCAGAGACACGGTAGGCAATG-3′；擴增片段為105 bp。將得到的陽性重組菌液擴大培養后，用Omega 質粒DNA 提取試劑盒提取質粒，超微量分光光度儀測質粒濃度，使用在線軟件http∶//www.endmemo.com/bio/dnacopynum.php 計算質粒的拷貝數。 將質粒稀釋至108copies， 再進行10 倍連續稀釋至101copies，共8 個梯度， 以此為標準質粒模板進行PCR 擴增，利用QuantStudioTMDesign & Analysis software 軟件分析，制作標準曲線，分別以FD201807 第3 代、6 代、8 代、10 代、12 代、15 代病毒DNA 為樣品，以MFF-1 細胞凍融液為陰性對照，超純水為空白對照，進行絕對定量PCR 擴增。通過標準曲線計算不同代次病毒DNA 的拷貝數。 反應體系：TB Green Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）（2×）10.0 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，Q-MCP-F（10 μM）0.8 μL，Q-MCP-F （10 μM）0.8 μL， 模板DNA 2.0 μL，補ddH2O 至總體積20.0 μL。 定量PCR 反應程序，預變性：95 ℃、30 s；PCR 反應：95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個循環；熔解曲線分析：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。

2.3 病毒的細胞熒光定位 將細胞接種于24 孔板上， 待細胞長滿單層后， 接種適量第14 代病毒液，5%CO2培養箱內27 ℃恒溫培養至細胞病變率達80%左右時，棄去培養基，加入200 μL -20 ℃預冷的無水甲醇固定15～20 min，加入200 μL 0.2% Triton X-100 透化15 min，10%山羊血清室溫靜置封閉1 h， 分別加入1∶5 000 稀釋的ISKNV-VP23 鼠單抗血清、1∶1 000 稀釋的ISKNV-VP101 兔多抗血清作為一抗，雙抗組同時加入兩種一抗血清，對照組加等量0.2 M PBS（pH7.2），室溫孵育1 h，分別加入相應的Alexa Fluor 488 標記的羊抗鼠IgG 綠色熒光二抗和Alexa Fluor 555 標記的羊抗兔IgG 紅色熒光二抗， 雙抗組同時加入兩種熒光二抗， 對照組加等量0.2 M PBS（pH7.2），室溫避光孵育1 h，加入1∶1 000細胞核染料，室溫避光孵育15 min，小心滴加少許封片劑Fluoroshield，以保持細胞濕潤，避免氣泡產生，立即放在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。病毒接種至核染每步驟結束后均用0.2 M PBS (pH7.2) 清洗3 次，每次5 min。

3 結 果

3.1 絕對定量檢測不同代次FD201807 病毒拷貝數將MCP 基因連接在pMD-19T 載體上獲得重組陽性菌液，提取重組質粒，測得濃度為130.723 ng/μL，估算其拷貝數約為2.94×1010copies/μL。根據熒光定量PCR 結果制作標準曲線，y=-2.898logx+33.641（見圖1）， 以此標準曲線計算得到細胞中不同代次FD201807 病毒的拷貝數 （見表1）。 顯示不同代次FD201807 病毒的拷貝數均在106～108copies/μL。

表1 不同代次FD201807 病毒液濃度

圖1 熒光定量PCR 中單位病毒拷貝數的CT 值標準曲線

3.2 細胞間接免疫熒光結果 細胞間接免疫熒光試驗結果見圖2， 圖中的細胞為病變率達80%以上的接毒細胞，同時使用ISKNV-VP23 鼠單抗血清和ISKNV-VP101 兔多抗血清作為一抗孵育， 其中A、B、C、D 為同一拍照區域在不同激發光下的圖片，藍色顯示細胞核， 綠色顯示ISKNV-VP23 鼠單抗血清，紅色顯示ISKNV-VP101 兔多抗血清。

圖2 FD201807-P14 感染MFF-1 72 h細胞間接免疫熒光照片

幾乎所有藍色的核染細胞均出現綠色和紅色熒光， 且細胞核大小不一、 形狀也不均勻， 結合了ISKNV-VP23 鼠單抗的綠色熒光蛋白均定位在細胞膜， 結合了ISKNV-VP101 兔多抗的紅色熒光蛋白均定位在細胞質。

4 討 論

由于病毒的特殊性， 若沒有合適的細胞系來培養病毒， 則無法深入開展病毒的相關研究。 自1999 年發現首例LYCIV 感染以來[2]，LYCIV 的研究進展緩慢， 二十年來開展的LYCIV 研究主要集中于病毒檢測方法的建立和部分功能基因的分析[7-10]。2008 年Dong 等[6]建立了對ISKNV 敏感的鱖魚仔魚細胞系（Mandarin fish fry cell line 1，MFF-1），并制備了多種ISKNV 的蛋白特異性抗體。 由于LYCIV與ISKNV 都屬于虹彩病毒科腫大細胞病毒屬，且ISKNV 是代表株，它們存在較高的親緣關系，所以本研究用MFF-1 培養FD201807 株，通過熒光定量PCR 測定病毒拷貝數，并用ISKNV 的特異性抗體來檢測感染MFF-1 的FD201807 病毒，看它們是否存在共同抗原。

絕對熒光定量結果顯示， 不同代次FD201807病毒的拷貝數均在106～108copies/μL， 說明其可在MFF-1 細胞上增殖復制，MFF-1 適合FD201807 毒株的胞內增殖。基于ISKNV-VP23 和ISKNV-VP101的細胞間接免疫熒光結果顯示，FD201807 病毒感染的MFF-1 細胞核均表現為大小不一、 形狀也不均勻，很可能是病變細胞發生了細胞核損傷，而受感染程度不同導致細胞核損傷程度差異。 ISKNV-VP23鼠單抗和ISKNV-VP101 兔多抗均可與感染FD201807 的MFF-1 細胞發生熒光反應， 說明FD201807 與ISKNV 存在共同抗原。結合了ISKNVVP23 鼠單抗的綠色熒光蛋白定位在細胞膜， 說明FD201807 上與ISKNV-VP23 同源的蛋白可能是膜結合蛋白， 而結合了ISKNV-VP101 兔多抗的紅色熒光蛋白定位在細胞質， 說明FD201807 上與ISKNV-VP101 同源的蛋白可能在胞質中組裝。ISKNV-VP23 蛋白表達于ISKNV 感染細胞的質膜上，不能作為病毒囊膜蛋白[11]，FD201807 中與之同源的是層粘連蛋白型表皮生長因子樣蛋白， 免疫熒光說明它可能與ISKNV-VP23 一樣表達于感染細胞的質膜上。

目前國內外關于LYCIV 的研究報道還很少，有必要加強對LYCIV 的侵染以及致病機制的研究，為魚類LYCIV 疫苗的開發提供依據。