基于Nrf2/BNIP3通路探討苓桂術(shù)甘湯改善心肌梗死誘導(dǎo)大鼠心力衰竭的作用及機(jī)制

王 翔,莫佳佳,湯同娟,周 鵬,黃金玲

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.合肥醫(yī)工醫(yī)藥股份有限公司,安徽 合肥 230601;3.安徽省藥物再創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心,安徽 合肥 230601;4. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,安徽 合肥 230012)

急性心肌梗死簡稱心梗,被認(rèn)為是心力衰竭發(fā)生最常見及最重要的起始因素之一[1],而心室重構(gòu)是心梗后引發(fā)心衰的基本病理基礎(chǔ),并貫穿心衰的始終[2]。因此,減緩或逆轉(zhuǎn)心梗后心室重構(gòu)是治療心衰的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)[3]氧化應(yīng)激參與了心室重構(gòu)的病理生理過程,是心室重構(gòu)的重要啟動機(jī)制之一。通過調(diào)控氧化應(yīng)激途徑進(jìn)行有效的抗氧化治療可改善梗死后心室重構(gòu),阻抑心衰的發(fā)展[4]。課題組前期研究表明中藥復(fù)方苓桂術(shù)甘湯可有效延緩心室重構(gòu)、改善心衰模型大鼠心功能[5-6]。近期研究發(fā)現(xiàn),該方可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/BNIP3 通路減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮心肌保護(hù)作用[7]。基于此,本研究旨在探討苓桂術(shù)甘湯抑制心室重構(gòu)防治心衰的作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)Nrf2/BNIP3信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物60只SD大鼠(♂、體質(zhì)量180～220 g)購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物許可證號為SCXK(魯)2019-003,飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(20～24 ℃),濕度(40%～60%)。

1.2 藥物苓桂術(shù)甘湯由茯苓(2005181)12 g、桂枝(2005181)9 g、白術(shù)(2002202)9 g、甘草(1911 041)6 g組成,藥物飲片均購于安徽普仁中藥飲片有限公司。參照課題組前期的提取方法[8]將苓桂術(shù)甘湯制備成含4.8 g生藥/g的干浸膏,分裝密封后保存于4 ℃冰箱。卡托普利片(1012016080156)購于中孚藥業(yè)股份有限公司。

1.3 試劑與儀器ROS、SOD檢測試劑盒(CA1410、BC0175)、天狼星紅染色液試劑盒(G1470)購自北京Solarbio;NT-proBNP、BNP檢測試劑盒(RX302959R、RX302462R)購自泉州睿信生物科技有限公司;CytC抗體(11940)購自美國CST 公司;Nrf2抗體(ab137550)、 BNIP3抗體(ab109362)、VDAC抗體(ab154856)、LaminA抗體(ab8980)、GAPDH抗體(ab181602)購自美國Abcam公司。 ACUSON OXANA彩色多普勒超聲診斷儀(德國西門子公司),ECG-2303B數(shù)字心電圖機(jī)(廣州市三銳電子科技有限公司),ATOM全自動酶聯(lián)免疫工作站(意大利MAROCHE),Tanon6600發(fā)光成像工作站(上海Tanon),H-7500型透射電鏡(日本HITACHI)。

1.4 動物分組與給藥動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,剔除不合格動物后參考文獻(xiàn)[9]并結(jié)合課題組前期經(jīng)驗,選用6-0眼科縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備心梗模型。假手術(shù)(Sham)組大鼠采用同樣的手術(shù)方式,但僅穿線不打結(jié)。每只大鼠予8萬U/d的青霉素溶液腹腔給藥,連續(xù)3 d,預(yù)防感染。結(jié)扎14 d后,將存活的模型大鼠隨機(jī)分成3組:模型(Model)組、苓桂術(shù)甘湯(LGZGD)組(劑量為4.2 g·kg-1)[6,10]和卡托普利(Captopril)組(劑量為0.002 57 g·kg-1),每組各10只。LGZGD組、Captopril組采用灌胃給藥,容積為10 mL·kg-1,Model組和Sham組灌以等容積的蒸餾水,每天1次,連續(xù)28 d。

1.5 標(biāo)本制備與采集行超聲檢測后,于腹主動脈處采取血液樣本,分離血清,分裝標(biāo)記好后放入-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩８怪鲃用}取血后,快速取出心臟,用冰的PBS溶液反復(fù)沖洗后剪去心耳、脂肪等附屬物,并用濾紙將液體吸干。在心臟結(jié)扎點之下進(jìn)行橫切,一部分組織固定于4%多聚甲醛中用做天狼星紅染色及免疫熒光檢測,一部分固定在2.5%戊二醛中用做透射電鏡分析,一部分組織剪成小塊后立即液氮速凍并放入-80 ℃的冰箱中凍存用做Western blot檢測。

1.6 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.6.1超聲心動圖檢測大鼠心臟功能 于末次灌藥后24 h,1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注入對大鼠進(jìn)行麻醉,固定備皮后在二維超聲引導(dǎo)下,通過M超在左室長軸切面水平測量左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole,LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension diastole,LVIDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)以及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.6.2ELISA法檢測血清BNP、NT-proBNP濃度 根據(jù)試劑盒說明采用ELISA法檢測大鼠血清中BNP、NT-proBNP的濃度。

1.6.3天狼星紅染色檢測心肌組織膠原纖維變化 將固定好的心臟組織切片,厚度6 μm,常規(guī)脫蠟水化;weigert鐵蘇木素染色液染色10 min;水洗5 min,蒸餾水洗一次;天狼星紅染色液滴染1 h;切片用水沖洗,脫水,清除,用中性樹膠密封;隨機(jī)選取一個視野運用顯微鏡(×400)拍照。

1.6.4免疫熒光法檢測心肌組織ROS、微量法檢測心肌組織SOD 稱取新鮮心肌組織,勻漿,低溫離心,取上清。ROS檢測:在96孔板中加入上清液與探針,混勻避光孵育后采用熒光分光光度計檢測熒光強(qiáng)度。SOD按照試劑盒說明書檢測。

1.6.5透射電鏡檢測心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu) 心肌組織用PBS沖洗干凈后,修剪成1 mm×1 mm×2 mm長條狀,2.5%濃度的戊二醛磷酸緩沖液固定2 h。然后在0.1 mol·L-1磷酸中漂洗和洗滌3次,1%鋨酸固定液固定3 h,而后用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次;脫水浸透包埋后,取出包埋樣品,用切片機(jī)將該組織切片切成超薄切片(50～70 nm);用乙酸雙氧鈾+檸檬酸鉛雙重電子染色后用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.6.6Western blot法檢測CytC、Nrf2蛋白表達(dá) 提取心肌組織蛋白、線粒體蛋白、細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞核蛋白,凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,加入合適濃度的一抗(CytC 1 ∶1 000、Nrf2 1 ∶1 000)孵育過夜,加入一定濃度的二抗,洗膜,將膜蛋白面與化學(xué)發(fā)光劑充分接觸5 min,然后用Tanon 6600發(fā)光成像工作站進(jìn)行檢測并使用Image Pro Plus 6.0軟件分析蛋白相對表達(dá)量。

1.6.7免疫熒光法檢測心肌組織Nrf2、BNIP3的表達(dá) 制作石蠟切片,脫蠟修復(fù),滴入濃度為5%的BSA封閉,滴加一抗(Nrf2 1 ∶200,BNIP3 1 ∶150),4 ℃孵育過夜;PBS清洗。切片甩干后,滴加二抗,室溫下孵育60 min,并避光;PBS清洗,滴加DAPI染液,室溫下避光孵育5 min;PBS清洗,滴加適量防熒光淬滅劑,樹脂封片劑封片,使用熒光顯微鏡在630×倍視野下隨機(jī)選擇視野進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡率及行為體征變化情況在藥物干預(yù)的28 d內(nèi),Model組大鼠有2只死亡,其余各組均無死亡。此外,實驗過程中Sham組大鼠進(jìn)食進(jìn)水量正常,活動狀態(tài)良好,毛發(fā)有光澤,沒有稀便;Model組大鼠進(jìn)食飲水量減少,活動性下降,喜聚堆,毛發(fā)不榮偏于萎黃,部分大鼠大便不成形,肛門周圍有污物;而LGZGD組及Captopril組活動狀態(tài)較Model組好,且LGZGD組大鼠,覓食積極性增加,毛發(fā)較為光滑,鮮出現(xiàn)稀便。

Fig 1 Ultrasound images of rats and analysis of ultrasonic index of rats in each

2.2 苓桂術(shù)甘湯對心梗后心衰大鼠心功能的影響如Fig 1所示,與Sham組大鼠比較,Model組大鼠的LVEF與LVFS均明顯降低(P<0.01),表明心肌梗死后大鼠的心功能嚴(yán)重受損;LVIDd和LVIDs均明顯增加(P<0.01),表明心梗后心衰大鼠的左室出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的擴(kuò)張,心室重構(gòu)明顯;而用LGZGD或Captopril治療后LVEF和LVFS均有明顯的升高(P<0.01),且左室擴(kuò)張導(dǎo)致的心室內(nèi)徑的增大也得到了明顯的改善(P<0.01),表明苓桂術(shù)甘湯可改善心梗后心衰大鼠的心功能。

2.3 苓桂術(shù)甘湯對心梗后心衰大鼠血清BNP、NT-proBNP的影響B(tài)NP、NT-proBNP被指南推薦為心梗后心衰的診斷、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的重要評價指標(biāo)。如Fig 2所示,Model組BNP、NT-proBNP較Sham組明顯升高(P<0.01),表明心肌梗死導(dǎo)致心衰的過程可使大量BNP、NT-proBNP合成并釋放入血,而用LGZGD或Captopril治療后可使上述指標(biāo)得到明顯改善(P<0.01),表明苓桂術(shù)甘湯可以防治心衰的發(fā)展。

2.4 苓桂術(shù)甘湯對心梗后心衰大鼠心肌組織膠原纖維變化的影響細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變是除細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變之外心室重構(gòu)的另一重要病理改變。如Fig 3所示,Sham組大鼠心肌組織可見少量紅染絲狀纖維,但沒有明顯的紅色膠原沉積,且肌絲排列有序且緊密;Model組大鼠心肌組織可看到膠原呈束狀浸潤性分布,且有大量的紅色膠原纖維沉積,肌絲排列紊亂;LGZGD或Captopril的治療改善了上述病理改變,紅色膠原物質(zhì)在兩組的心肌細(xì)胞中明顯減少,極大改善了膠原沉積。表明苓桂術(shù)甘湯可以減輕心肌間質(zhì)膠原的過度沉積。

Fig 2 Changes of serum BNP and NT-ProBNP in rats of each

Fig 3 Sirius staining results of myocardial tissue of rats in each group(×400)

2.5 苓桂術(shù)甘湯對心梗后心衰大鼠心肌組織ROS、SOD的影響如Fig 4所示:與Sham組相對比,Model組大鼠心肌組織中的ROS水平升高(P<0.01),且伴隨著SOD活性明顯下降(P<0.01);而經(jīng)LGZGD或Captopril治療后,與Model組相比較,ROS水平明顯降低(P<0.01),而SOD活性明顯提升(P<0.01),上述結(jié)果表明苓桂術(shù)甘湯具有減輕心梗后心衰大鼠氧化應(yīng)激的作用。

Fig 4 Detection results of oxidative stress indicators |ROS, SOD in rat myocardial )

2.6 苓桂術(shù)甘湯對心梗后心衰大鼠線粒體損傷的影響如Fig 5 所示,Sham組線粒體排列有序,形態(tài)與數(shù)量均正常,線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊;在Model組大鼠心肌組織的線粒體上可觀察到一部分發(fā)生固縮變小,一部分發(fā)生腫脹或者外膜破損或呈明顯空泡化,部分線粒體出現(xiàn)嵴斷裂;LGZGD或Captopril治療后,大鼠心肌組織線粒體腫脹程度與空泡化明顯減輕,嵴大致趨于正常。上述結(jié)果表明苓桂術(shù)甘湯可有效抑制氧化應(yīng)激所致的線粒體損傷。

Fig 5 Observation of structure changes of mitochondria in myocardial tissue of rats in each group under electron microscope (×10k)

2.7 苓桂術(shù)甘湯對心梗后心衰大鼠心肌組織線粒體CytC、細(xì)胞質(zhì)CytC的影響CytC的釋放是細(xì)胞線粒體途徑凋亡的標(biāo)志。如Fig 6所示,相對于Sham組,Model組大鼠線粒體CytC降低、細(xì)胞質(zhì)CytC含量升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),表明心梗后心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體中的CytC釋放到細(xì)胞質(zhì);而經(jīng)LGZGD或Captopril治療后,與Model組相比,線粒體CytC含量明顯升高(P<0.05),而細(xì)胞質(zhì)CytC含量明顯降低(P<0.05),上述結(jié)果表明苓桂術(shù)甘湯可減少線粒體CytC的釋放,抑制線粒體凋亡途徑。

2.8 苓桂術(shù)甘湯對心肌組織Nrf2、BNIP3表達(dá)的影響如Fig 7、8所示,與Sham組相比,Model組Nrf2表達(dá)量上升(P<0.01),且有少量Nrf2入核(P<0.05);與Model組相比,LGZGD或Captopril組Nrf2表達(dá)量明顯上升(P<0.01),且Nrf2大量入核(P<0.01)。如Fig 9所示,Sham組中的BNIP3熒光強(qiáng)度較低,表達(dá)量較少;與Sham組相比,Model組綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng),BNIP3表達(dá)量明顯上升(P<0.01);與Model組相比,LGZGD和Captopril熒光強(qiáng)度降低,BNIP3表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。提示苓桂術(shù)甘湯可以促進(jìn)Nrf2的表達(dá)及核移位,降低BNIP3的表達(dá)。

Fig 6 Mitochondrial CytC and cytoplasmic CytC test results of myocardial cell apoptosis indexes in each )

Fig 7 Immunofluorescence staining of Nrf2 in myocardial tissue ,n=3)

Fig 8 Mitochondrial Nrf2 and cytoplasmic Nrf2 test results of myocardial cell apoptosis indexes in each

3 討論

AMI后心室重構(gòu)為AMI后心室在大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能上發(fā)生改變的過程。研究表明[3]心梗后的心室重構(gòu)涉及氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,而由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡效應(yīng)參與心室重構(gòu)的全過程。心肌細(xì)胞的凋亡主要通過線粒體途徑與死亡途徑產(chǎn)生,其中線粒體途徑在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著不可或缺的作用,當(dāng)線粒體受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)時,ROS可介導(dǎo)線粒體損傷,線粒體結(jié)構(gòu)與功能會發(fā)生亞水平上的重構(gòu),激活凋亡細(xì)胞激酶,并將凋亡基因調(diào)節(jié)蛋白如CytC等釋放入細(xì)胞質(zhì),進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,使心肌組織功能受損加劇,心臟重構(gòu)加重,最終導(dǎo)致心衰。

Nrf2是一種氧化應(yīng)激敏感的轉(zhuǎn)錄因子,已被證明受ROS水平的影響,一旦被激活,它可以由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),通過影響ROS的合成、控制內(nèi)源性抗氧化劑產(chǎn)生來維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài),有效抵御細(xì)胞的損傷與凋亡。研究發(fā)現(xiàn)Nrf2在心血管疾病的防治中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[11]。敲除Nrf2基因的小鼠會出現(xiàn)左心室舒張功能障礙,并迅速從心臟代償適應(yīng)過渡到心衰,而過表達(dá)的Nrf2可有效保護(hù)受H2O2誘導(dǎo)的心肌損傷后心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)和功能[12-13]。受Nrf2調(diào)控的BNIP3是最新發(fā)現(xiàn)的氧化應(yīng)激線粒體傳感器[14],ROS的增加可誘導(dǎo)其激活,激活后的BNIP3可進(jìn)入線粒體外膜,引起線粒體的腫脹,促進(jìn)CytC的釋放進(jìn)而介導(dǎo)線粒體功能障礙,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡[15]。同時被激活的BNIP3基因亦可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,加重線粒體功能的失調(diào)[16]。研究表明[17]BNIP3參與誘導(dǎo)心梗后的心室重構(gòu)過程,下調(diào)BNIP3可減少體內(nèi)細(xì)胞凋亡,抑制心肌梗死后誘發(fā)的心室重構(gòu),有效防治小鼠心衰的發(fā)展。

Fig 9 Immunofluorescence staining of

研究發(fā)現(xiàn)[18]冠脈成功結(jié)扎后的2～6周即可形成心衰。因此本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上,于結(jié)扎后的第14 天開始給藥,連續(xù)給藥28 d。超聲結(jié)果表明模型大鼠出現(xiàn)了左心室的擴(kuò)張,心室順應(yīng)性的降低(LVIDs、LVIDd升高),左室泵血功能降低(LVEF、LVFS下降),結(jié)合模型大鼠血清中心衰標(biāo)志物BNP、NT-proBNP的明顯升高,以及心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死及嚴(yán)重的纖維化,表明大鼠的心臟功能嚴(yán)重受損,提示心梗后心衰模型建立成功。Captopril為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑,是臨床上治療心力衰竭的基礎(chǔ)用藥之一,本研究選擇captopril作為陽性對照藥物,在研究中發(fā)現(xiàn)captopril及LGZGD均能有效降低心衰大鼠的死亡率,但相對于captopril,LGZGD可明顯改善模型大鼠的毛發(fā)光澤度、提高食欲、減少其稀便癥狀,在提高心衰大鼠的生存質(zhì)量上具有獨特優(yōu)勢。另本研究發(fā)現(xiàn)在模型動物心肌組織中可檢測到ROS的升高與SOD的降低,表明氧化應(yīng)激參與了心梗后心衰的過程,且透射電鏡結(jié)果顯示心梗后心衰模型大鼠出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)的損傷。線粒體受氧化應(yīng)激損傷后,引起模型動物線粒體CytC的大量釋放,導(dǎo)致了心臟功能的障礙。此外,免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示模型動物Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)運應(yīng)激性增加,BNIP3蛋白表達(dá)明顯增加,這些變化提示氧化應(yīng)激引起了Nrf2 的解離,促進(jìn)BNIP3的高表達(dá),從而啟動了線粒體凋亡途徑。而LGZGD的干預(yù)可以減輕心梗后心衰模型大鼠的氧化應(yīng)激水平,保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu),減少心肌細(xì)胞的凋亡,且可促進(jìn)Nrf2的核移位,降低BNIP3的表達(dá),從而發(fā)揮治療心衰的作用。值得注意的是,在本研究中LGZGD干預(yù)后隨著心肌組織細(xì)胞Nrf2的核移位的明顯增加,胞質(zhì)中Nrf2蛋白表達(dá)卻無明顯降低,這可能與LGZGD干擾了Keap1-Nrf2結(jié)合,使Nrf2從泛素化系統(tǒng)中釋放,從而減少Nrf2的降解,補(bǔ)償細(xì)胞質(zhì)的Nrf2有關(guān)[19-20]。

綜上,本研究以影響心衰進(jìn)程中心室重構(gòu)的主要影響因素—氧化應(yīng)激為主要切入點,提出并證實了Nrf2/BNIP3通路參與心梗后心衰病理生理過程的重要分子機(jī)制,為心衰的防治提供了潛在的有效治療靶點。通過實驗發(fā)現(xiàn),苓桂術(shù)甘湯對心梗后心衰大鼠外在表征、心臟功能、組織病理學(xué)、線粒體功能、蛋白表達(dá)等各個層面均有較好的改善與調(diào)節(jié)作用,充分反映了中藥復(fù)方多層面、多環(huán)節(jié)、多靶點的綜合治療作用,為經(jīng)方防治心衰的臨床應(yīng)用提供了一定的理論與實驗依據(jù)。