從內質網應激研究高脂飲食對小鼠睪丸生精細胞凋亡的影響

周本文,張長城,鄧 何,陳思敏,常言語,楊焱娜,付國慶,袁 丁,趙海霞

(三峽大學 1.國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室、2.基礎醫學院、3.健康醫學院,湖北 宜昌 443002)

肥胖與飲食結構密切相關,臨床研究表明,肥胖是引起男性生育能力低下的重要因素[1]。過量攝入脂肪酸會增加患弱精子癥的概率;此外,精漿中總膽固醇和甘油三酯水平與精液質量呈負相關,與精子DNA碎片指數呈正相關[2]。動物研究發現,長期高脂飲食誘導的肥胖可導致小鼠[3]或大鼠[4]生殖細胞過度凋亡,進而導致睪丸組織結構損傷,精液質量下降,最終導致小鼠或大鼠生育能力低下甚至不育。因此,睪丸生精細胞的異常凋亡可能是肥胖相關的雄性生精功能障礙的關鍵。然而,其具體分子機制在很大程度上仍然未知。

研究表明[5],內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)與高脂飲食密切相關。而ERS對于維持睪丸正常的生殖功能發揮著不可或缺的作用,ERS損傷通常是引起睪丸精子發生異常的重要誘因[6]。然而,持續過度的ERS會誘導睪丸生精細胞凋亡,進而導致睪丸生殖功能受損,影響正常的精子發生[7]。有研究發現[8],高脂飲食可通過激活肝臟ERS誘導肝細胞凋亡。那么,高脂飲食誘導的生精細胞凋亡是否與睪丸ERS有關,還有待進一步研究。因此,本實驗首先檢測高脂飲食對生精細胞凋亡的影響,然后從內質網跨膜蛋白PERK、IRE1和ATF6介導的ERS的3條信號通路來研究高脂飲食對小鼠睪丸ERS的作用,初步探討ERS在高脂飲食誘導的小鼠睪丸生精細胞凋亡中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物12只5周齡無特定病原體級的C57BL/6J雄性小鼠購買并飼養于三峽大學實驗動物中心,室溫23 ℃～26 ℃、相對濕度60%～65%,照明系統自動控制12 h明暗交替循環。動物生產許可證號:SCXK(鄂)2017-0012。所有小鼠可進行自由進食與飲水,適應性飼養1周后分組處理。動物實驗通過三峽大學動物實驗倫理委員會的批準,并且按照“三峽大學實驗動物護理和使用指南”開展,實驗動物設施使用許可證號:SYXK(鄂)2017-0061。

1.2 試劑β-actin(AC026)購自ABclonal公司;GRP78(abs130538)購自Absin公司;p-IRE1(NB100-2323)購自Novus公司;XBP1(ab37152)、eIF2S1 (phospho S51)(ab32157)和ATF4(ab184909)購自Abcam公司;p-pERK(Thr 981)(sc-32577)和ATF6α(SC-166659)購自Santa cruz公司;Bcl-2(26593-1-AP)和Bax(50599-2-Ig)購自Proteintech公司;cleaved-caspase-12(#35965)購自Cell Signaling Technology公司;牛血清白蛋白(BSA)(154707)和anti-Rabbit lgG(H+L)(KR0023)購自武漢科瑞生物有限公司;anti-mouse lgG(H+L)(115-035-003)和Alexa Fluor488 Donkey Anti-Rabbit lgG(H+L)(711-545-152)購自Jackson immunoresearch公司;RIPA裂解液試劑盒(EXP202304)和BCA蛋白定量試劑盒(EXP202310)購自北京普利萊基因技術有限公司;ECL化學發光試劑盒(CR2204003)、4%多聚甲醛(CR2209049)和抗熒光淬滅封片劑(CR2207103)購自Servicebio公司;YF 594 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(T6014S)購自百賽生物公司。

1.3 儀器LEICA TP1020型全自動脫水機和LEICA EG1150H型包埋機購自德國Leica公司;YD-335型切片機購自湖北澤川科技有限公司;DP260全自動智能染色機購自深圳市達科為公司;AX224ZH/E型電子天平購自奧豪斯儀器有限公司;BX53光學顯微鏡購自日本Olympus公司;TYPE1500-458型酶標儀購自美國Thermo Electron公司;RX50熒光顯微鏡購自北京舜宇光學儀器公司;ChemiScope 6100型化學發光儀購自上海勤翔科學儀器公司;PowerPac 200型Western blot電泳儀購自英國Bio-Rad公司;DS1000型組織勻漿儀購自湖北新縱科公司。

1.4 方法

1.4.1分組給藥 將12只6周齡無特定病原體級的C57BL/6J雄性小鼠按隨機數字表法分為2組,即正常飲食(Normal diet,ND)組和高脂飲食(High-fat diet,HFD)組,每組6只,分籠(3～4只/籠)。HFD組小鼠給予含60%脂肪的高脂飼料喂養,ND組小鼠給予普通的維持飼料喂養,持續喂養5個月。高脂飼料(編號H10060)購于北京華阜康生物科技股份有限公司,能量配比(Kcal):脂肪占0.60,蛋白質占0.20,碳水化合物占0.20。

1.4.2小鼠體質量和睪丸指數的測定 造模結束后,所有小鼠禁食不禁水12 h,稱體質量,以200 g·L-1的烏拉坦腹腔麻醉小鼠,頸椎脫臼法處死小鼠,于低溫環境中迅速摘取并分離小鼠睪丸和附睪,稱質量并計算睪丸指數,睪丸指數(mg·g-1)=睪丸質量(mg)/體質量(g)。

1.4.3精液分析 將兩側附睪組織迅速放入含有1 mL的生理鹽水中,并將附睪組織剪碎,放置在37 ℃恒溫箱中孵育3 min,使附睪中精子充分游離出來,制備精子懸液。將20 μL精子懸液和480 μL生理鹽水充分混勻,取10 μL稀釋后的精子懸液采用血球計數板在光鏡下觀察并計數精子的數量,計算精子濃度,精子濃度(mL)=計數板4象限中精子的平均數×104×稀釋倍數。另取10 μL精子懸液與10 μL伊紅Y溶液充分混勻后,滴加到載玻片上,染色30 s后在顯微鏡下觀察精子的活率,計數活精子數和精子總數,計算精子活率,精子活率=活精子數/精子總數×100%。

1.4.4HE染色觀察睪丸組織形態 睪丸組織脫水、包埋:睪丸組織取材后迅速放入含4%多聚甲醛的離心管中浸泡24 h,使組織充分固定。將組織轉移置自動脫水機中進行脫水,脫水程序結束后將組織轉移至石蠟包埋機中(提前預熱包埋機),將組織放入包埋夾中制成石蠟塊。石蠟切片:將組織蠟塊用切片機進行切片,厚度為4 μm。HE染色和取圖:采用自動染色機對組織切片進行HE染色,染色結束后立即用中性樹脂進行封片。取圖:將切片于光學顯微鏡下觀察睪丸生精小管和生精上皮的形態結構并取圖。根據光鏡下采集的放大倍數為100倍的圖片,使用ImageJ軟件測量每個生精小管的直徑和上皮厚度,每組統計6只小鼠,每只小鼠統計80～100個生精小管,計算平均值并進行統計分析。

1.4.5TUNEL染色檢測睪丸凋亡細胞 將包埋好的睪丸石蠟塊進行切片(方法同HE染色),將切片進行脫蠟水化,每個組織上加入100 μL蛋白酶K溶液,并置于37℃恒溫箱孵育30 min,PBS漂洗3次,然后按照試劑盒說明書中的實驗步驟進行TUNEL反應,反應結束后,將組織用PBS漂洗3次,隨后DAPI復染,抗熒光淬滅劑封片,在熒光顯微鏡下觀察,隨機選取100個生精小管,計數TUNEL陽性細胞數,計算凋亡指數(凋亡指數=TUNEL陽性細胞數/100),每組統計3只小鼠。

1.4.6Western blot檢測睪丸凋亡及ERS相關蛋白的表達水平 蛋白提取:使用電子天平稱取20 mg的睪丸組織,加入400 μL的RIPA裂解液,放入勻漿儀中進行碾碎,然后置于冰上裂解1 h。提前預冷離心機,設置轉速為12 000 r·min-1,將組織4 ℃離心10 min,收集上清液即蛋白提取完成。蛋白樣品濃度的測定:于96孔板中每孔依次加入25 μL的PBS緩沖液、2.5 μL提取的蛋白母液和200 μL的BCA工作液,37 ℃恒溫箱孵育30 min。采用酶標儀檢測蛋白樣品在562 nm處的A值,根據標準曲線計算蛋白母液的濃度。Western blot:取100 μL的蛋白液加入25 μL上樣緩沖液,充分渦旋混勻,將蛋白樣品于100 ℃水浴鍋中加熱10 min,使蛋白充分變性。將制好的蛋白樣品進行電泳,轉膜。將轉膜完成的條帶使用質量分數為5%的牛奶室溫封閉1 h,然后在4 ℃孵育一抗12～14 h,TBST洗膜3次(6 min/次),室溫繼續孵育二抗1 h,TBST洗膜3次(6 min/次)后,最后在化學發光儀中顯影。

1.4.7免疫熒光檢測睪丸組織中GRP78的表達和定位 取睪丸組織切片在60 ℃烤箱中烘烤30 min,將切片浸入二甲苯中脫蠟(30 min),然后分別放入梯度乙醇(100%、95%、85%、70%)中復水(每次10 min),隨后將組織切片放入檸檬酸修復液中,高壓修復10 min,冷卻至室溫,在組織上加入質量分數為5% BSA溶液室溫封閉60 min,隨后去掉封閉液,在組織上加入GRP78一抗稀釋液并將切片放入濕盒中,置于4 ℃孵育12～14 h。孵育結束取出濕盒,復溫30 min。去掉一抗稀釋液,采用PBS緩沖液漂洗5次(6 min/次)。滴加Alexa Fluor488 Donkey Anti-Rabbit lgG(H+L)抗體稀釋液,在室溫條件下孵育60 min,PBS浸洗30 min(同上,從此步驟開始全程均避光操作),滴加DAPI工作液染色10 min,PBS漂洗3次,每次10 min,使用抗熒光淬滅劑封片。在熒光顯微鏡下觀察小鼠睪丸組織中GRP78蛋白的表達及定位,每個組織隨機選取3～5個視野采集圖像,每組檢測3只小鼠。

2 結果

2.1 高脂飲食對小鼠體質量和睪丸指數的影響結果如Fig 1所示,與ND組相比,HFD組小鼠體質量明顯增加(P<0.01),睪丸指數明顯下降(P<0.05)。

Fig 1 Effects of high-fat diet on body weight and testicular index of mice

2.2 高脂飲食對小鼠精子濃度和精子活率的影響結果如Fig 2A所示,活的精子不被伊紅Y染色,而死精子則被伊紅Y染成紅色,與ND組相比,HFD組小鼠死的精子明顯增多;統計結果顯示,HFD組小鼠精子濃度(P<0.05)和精子活率(P<0.01)明顯下降,見Fig 2B,C。

Fig 2 Effects of high-fat diet on sperm concentration and sperm viability of mice

2.3 高脂飲食對小鼠睪丸組織形態的影響結果如Fig 3A所示,ND組小鼠生精上皮結構完整,各級生精細胞從生精小管基底向管腔排列且緊密有序;與ND組相比,HFD組小鼠睪丸各級生精細胞排列松散、紊亂、基底層生精細胞出現脫落,生精細胞層數減少。生精上皮厚度和生精小管直徑統計結果顯示,與ND組相比,HFD組小鼠生精上皮厚度變薄(P<0.05),生精小管直徑差異無統計學意義,見Fig 3B,C。

2.4 高脂飲食對小鼠睪丸生精細胞凋亡的影響TUNEL染色結果顯示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸組織中TUNEL陽性的細胞明顯增多。結果顯示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸凋亡指數明顯上升(P<0.01),見Fig 4。

Fig 3 Effects of high-fat diet on morphology of testicular tissue of mice

2.5 高脂飲食對小鼠睪丸組織中Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-12蛋白表達的影響采用Western blot法對睪丸組織中Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-12的表達水平的進行檢測,研究高脂飲食對小鼠睪丸生精細胞凋亡的影響,結果如Fig 5所示,與ND組相比,HFD組Bax和cleaved-caspase-12蛋白表達水平明顯上升(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降(P<0.05),而Bax與Bcl-2蛋白表達水平的比值明顯上升(P<0.01)。以上結果提示,高脂飲食可誘導小鼠睪丸生殖細胞凋亡。

2.6 高脂飲食對小鼠睪丸組織GRP78蛋白表達及定位的影響為了研究高脂飲食對小鼠睪丸ERS的影響,首先采用Western blot法檢測睪丸ERS標志蛋白GRP78的表達量的變化,結果如Fig 6A所示,高脂飲食可明顯上調睪丸組織GRP78蛋白表達水平(P<0.05)。隨后采用免疫熒光法進一步檢測睪丸生精上皮細胞中GRP78蛋白表達和定位的變化,結果如Fig 6B所示,在正常小鼠睪丸生精細胞中GRP78主要表達于生精上皮初級精母細胞的胞質中,呈圓環狀包圍在細胞核外側(白色箭頭所示)。與ND組相比,HFD組小鼠睪丸生精細胞中GRP78表達明顯增多,表達位置無明顯變化。結果提示,高脂飲食可誘導小鼠睪丸生精細胞ERS。

Fig 4 Effects of high-fat diet on apoptosis of germ cells

Fig 5 Effects of high-fat diet on apoptosis related protein expression of mouse testicular tissue

2.7 高脂飲食對小鼠睪丸組織PERK信號通路相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸組織中p-PERK和p-eIF2α蛋白表達有上升的趨勢,但差異無統計學意義,而ATF4蛋白的表達無明顯變化,見Fig 7。

2.8 高脂飲食對小鼠睪丸組織IRE1信號通路相關蛋白表達的影響結果如Fig 8所示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸組織中p-IRE1和XBP1蛋白的表達水平明顯上調(P<0.05)。結果提示,高脂飲食可通過激活IRE1信號通路,引發睪丸ERS。

Fig 6 Effects of high-fat diet on GRP78 expression of mouse testicular or 4)

Fig 7 Effects of high-fat diet on expression of PERK signaling pathway related proteins in mouse testicular tissue

Fig 8 Effects of high-fat diet on expression of IRE1 signaling pathway related proteins in mouse testicular tissue *P<0.05 vs ND group.

2.9 高脂飲食對小鼠睪丸組織ATF6信號通路相關蛋白表達的影響結果如Fig 9所示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸組織中ATF6α蛋白表達水平明顯上調(P<0.05)。結果提示,高脂飲食可激活ATF6信號通路。

Fig 9 Effects of high-fat diet on expression of ATF6 signaling pathway related proteins in mouse testicular tissue *P<0.05 vs ND group.

3 討論

在全球范圍內,超重和肥胖的人群越來越多,約13%的成年人肥胖,并且在未來幾年將繼續迅速上升。肥胖與飲食結構密切相關,高脂肪高熱量飲食更容易引起體質量增加,導致高脂血癥,引發代謝相關等疾病,并且經常會導致雄性睪丸功能受損和生育能力低下[9]。研究表明,高脂飲食可誘導雄性小鼠和大鼠精子數量和活力降低,導致睪丸組織結構受損,生精細胞凋亡增加,進而導致其生育力受損甚至不育[10]。然而,外界條件刺激引起的生精細胞凋亡是導致雄性生殖功能障礙的關鍵因素之一。有研究發現,小鼠腹腔注射飽和脂肪酸棕櫚酸可誘導睪丸脂質積累,生精細胞凋亡增多進而導致小鼠生殖功能障礙;體外實驗亦表明棕櫚酸可誘導凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2表達的比值和cleaved-caspase-12蛋白的表達上調,導致精原細胞凋亡[11]。本研究發現,高脂飲食可誘導小鼠體質量明顯增加,睪丸指數降低,小鼠精子濃度和活率明顯下降,睪丸組織結構出現明顯的損傷,生精細胞排列紊亂,生精上皮結構松散,基底層生精細胞脫落,生精上皮厚度變薄,睪丸組織中凋亡細胞數明顯增多,凋亡指數明顯增加。另外,Western blot結果顯示,高脂飲食可誘導小鼠睪丸組織中凋亡相關蛋白Bax和cleaved-caspase-12的表達明顯升高,而Bcl-2蛋白的表達明顯下降,Bax與Bcl-2表達水平的比值明顯升高。以上結果表明,高脂飲食可誘導睪丸生精細胞凋亡,進而導致小鼠睪丸功能損傷,與報道的研究結果一致。因此本實驗將進一步從ERS的角度探究高脂飲食誘導睪丸生精細胞凋亡的機制。

內質網是細胞中調節蛋白質的合成與加工、脂質的生物合成、細胞凋亡和鈣穩態等的重要細胞器。當細胞受到氧化應激、蛋白質錯誤折疊或脂質穩態失衡等刺激時,就會引發細胞ERS,進而激活細胞內的未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)信號通路。UPR通過調節下游相關基因的表達來提高內質網的應激處理能力,進而恢復內質網穩態。在正常生理水平狀態下,內質網膜上的PERK、IRE1和ATF6蛋白與分子伴侶蛋白GRP78結合而處于非激活狀態。當細胞內ERS發生時,GRP78就會與PERK、IRE1和ATF6蛋白發生解離,隨后PERK和IRE1通過自磷酸化而被激活,進而激活下游分子;而ATF6則轉移至高爾基體進而被活化,促進內質網靶基因的表達,促進細胞內穩態的維持。PERK信號通路激活能減少蛋白質的合成,IRE1和ATF6信號通路被激活能增加GRP78的合成,增強內質網對蛋白質的折疊、轉運及降解。然而,當UPR不能有效緩解持續過度的ERS時,則會啟動細胞凋亡程序,誘導細胞發生凋亡。caspase-12是結合在內質網膜上的天冬氨酸水解酶,在ERS誘導細胞凋亡的過程中發揮著關鍵作用,在ERS過程中被特異性地剪切為活化的cleaved-caspase-12,并進入到細胞的胞質中,激活caspase-3,誘導細胞進入凋亡程序[12]。

研究表明,持續過度的ERS是引發細胞凋亡的關鍵因素,而ERS的發生又與高脂飲食誘導的肥胖及糖尿病等代謝性疾病有密切關聯[13]。有研究發現,高脂飲食可明顯增加小鼠肝臟和附睪脂肪組織中GRP78的表達,通過促進GRP78與IRE1和ATF6的解離,激活IRE1和ATF6信號通路誘導持續過度的ERS,導致脂肪積累和胰島素抵抗[14-15]。另有研究發現,高脂飲食可通過IRE1和eIF2α信號通路激活肝細胞ERS,進而誘導大鼠肝細胞凋亡[8];高脂飲食通過誘導小鼠膝關節軟骨細胞中PERK信號通路相關蛋白p-PERK和ATF4以及IRE1信號通路相關蛋白p-IRE1和XBP1的表達增加,激活ERS,誘導軟骨細胞凋亡[16]。本研究發現,高脂飲食可誘導小鼠睪丸組織中GRP78表達明顯增加,同時,IRE1信號通路相關蛋白p-IRE1和XBP1以及ATF6信號通路相關蛋白ATF6α的表達明顯上調,而PERK信號通路相關蛋白p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表達無明顯變化。然而,Xu等[17]通過體外研究發現,棕櫚酸可通過激活PERK和IRE1信號通路上調p-PERK、ATF4和p-IRE1的表達激活ERS,誘導精原細胞系GC-1細胞凋亡;Mu等[11]的研究結果顯示,高脂飲食可通過增加小鼠睪丸ERS相關蛋白GRP78,及ATF6和XBP1的表達誘導睪丸ERS,進而導致小鼠生精功能障礙,與本研究結果相一致,提示,高脂飲食可通過激活小鼠睪丸組織中IRE1信號通路和ATF6信號通路,誘導睪丸ERS。而Xu等[17]體外研究結果表明,棕櫚酸誘導的脂毒性可激活精原細胞的PERK信號通路,誘導ERS,這可能是造模的方式不同所引起的生精細胞的損傷程度存在差異,因此,還需要后期通過體內外實驗相結合的方式更加深入的研究其作用的分子機制。

綜上所述,高脂飲食可通過誘導生精細胞凋亡進而導致小鼠睪丸功能障礙,與激活IRE1信號通路和ATF6信號通路誘導睪丸內質網應激有關。因此,緩解內質網應激、減輕生殖細胞凋亡可能是改善高脂飲食誘導的雄性生殖功能障礙的關鍵。本研究為治療肥胖相關的雄性生殖功能障礙提供了一定實驗數據和理論基礎,但高脂飲食主要通過誘導哪一種生精細胞凋亡,并且抑制UPR中IRE1和ATF6信號通路是否能改善其凋亡還有待進一步研究。