Hippo-YAP通路參與NaAsO2對PC12細胞周期及細胞凋亡的影響

吳 松,顧 丹,張小龍,康文潤,劉 宇,李 成,王宏健,王東艷,潘際剛

( 貴州醫科大學基礎醫學院1.生理學教研室、2.機能實驗室,貴州 貴陽 550025)

砷是一種在自然界中廣泛存在的非金屬元素,人群常通過水、食物和空氣等途徑接觸砷而導致人體砷中毒[1]。我國是砷污染較為嚴重的國家,其中貴州是我國一個典型的燃煤污染型地方性砷中毒病區[2]。經過流行病學調查,發現砷可造成包括心血管系統、呼吸系統、神經系統、內分泌系統和皮膚在內的許多人體系統和器官的毒性損傷[3]。砷可誘發中樞和周圍神經病變,導致多發性神經炎和神經衰弱等疾病[4]。但是,砷引起神經損傷的具體機制至今仍不十分明確。Hippo-YAP信號通路的核心部分是由3個激酶組成的級聯反應構成,分別是哺乳動物STE20樣蛋白激酶1/2(mammalian STE20-like protein kinase 1/2,MST1/2),大腫瘤抑制因子1/2 (large tumor suppressor 1/2,LATS1/2) 和最終效應因子Yes 相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)[5]。此通路在調節細胞周期、控制細胞增殖與凋亡方面有重要作用,并且在進化上高度保守[6]。本課題組前期研究已經證明,NaAsO2能激活Hippo-YAP通路,誘導PC12細胞凋亡,促進細胞S期阻滯[7],而且Hippo-YAP通路參與NaAsO2影響PC12細胞活力、形態及突觸后致密蛋白95(post synaptic density protein,PSD95)、突觸素蛋白(synaptophysin,SYN)表達[8]。那么,Hippo-YAP信號通路是否參與NaAsO2對PC12細胞周期及細胞凋亡的影響,本實驗將在前期研究基礎上對這些問題進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 PC12細胞株,從中科院昆明細胞庫購買。

1.1.2試劑 亞砷酸鈉(S7400)購于美國Sigma 公司。青霉素 - 鏈霉素(15140163)、高糖DMEM培養基(8120293)和胰蛋白酶(25200056)均購自Gibco公司。胎牛血清(10099141C)于BioInd 公司購買。XMU-MP-1(HY-100526)購自MCE公司。一抗抗體LATS1(17049-1-AP)、MST1(22245-1-AP)、YAP1(13584-1-AP)、BAX(50599-2-Ig)、p53(10442-1-AP)和BCL-2(12789-1-AP)均在 ProteintechGroup公司購買。Phospho-MST1(49332S)和Phospho-LATS1(9157S)購自Cell Signaling Technology。Phospho-YAP1(ab76252)訂購自Abcam。內參抗體Tubulin(11224-1-AP)、Histone-H3(17168-1-AP)和GAPDH(10494-1-AP)于ProteintechGroup公司訂購。抗兔 IgG-HRP二抗(ZB-2305)從北京中衫金橋訂購。細胞周期檢測試劑盒(KGA512)及細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC /PI( KGA1012)于凱基生物購買。核蛋白提取試劑盒(R0050)從索萊寶購買。

1.1.3儀器 流式細胞儀FACSCalibur(美國BD公司),細胞超凈工作臺(蘇州凈化),凝膠全自動成像儀(美國 SynGene公司),全波長多功能酶標儀(美國 BioTek 公司),恒溫二氧化碳細胞培養箱Model 310(美國ThermoFisher公司),激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 PC12細胞置于飽和濕度、37 ℃和5% CO2的培養箱中,用含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM全培養基進行培養。培養基兩天更換一次,細胞融合度達到80%時,進行傳代或凍存。

1.2.2細胞處理及分組 免疫熒光實驗將細胞分為control組和NaAsO2(40 μmol·L-1)組,其余實驗將細胞分為control組、NaAsO2(40 μmol·L-1)組、NaAsO2+XMU-MP-1(3 μmol·L-1)組、XMU-MP-1組。

1.2.3細胞周期檢測 PC12細胞以5×108L-1的密度鋪于6孔板中培養過夜。以含3 μmol·L-1XMU-MP-1的高糖DMEM培養基對NaAsO2+XMU-MP-1組及XMU-MP-1組細胞預處理4 h。之后分別用含40 μmol·L-1NaAsO2、40 μmol·L-1NaAsO2+3 μmol·L-1XMU-MP-1、3 μmol·L-1XMU-MP-1的高糖培養基處理細胞,空白對照組以高糖培養基培養。細胞處理24 h,無EDTA胰酶消化并收集。使用PBS進行清洗,然后以1 100 r·min-1的速度離心5 min,這個步驟重復2次,并且丟棄上清液。接著,使用70%的乙醇在4 ℃下固定30 min,固定完成后以1 100 r·min-1的速度離心5 min并丟棄固定液。再次使用PBS清洗2次,加入300 μL的PI/RNase,避光在室溫下孵育60 min。最后,使用流式細胞儀對細胞樣品進行檢測。

1.2.4流式細胞儀檢測PC12細胞凋亡 本實驗分組以及細胞收集、固定步驟同“1.2.3”。接著PBS洗2次,1 100 r·min-1離心棄上清。加500 μL PBS吹打得細胞懸液。然后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI振蕩混勻,避光冰上靜置20 min ,用流式細胞儀檢測。

1.2.5核質分離 在處理完所有細胞組后,移除培養液并用PBS進行一次清洗。然后,使用細胞刮刀收集細胞,以2 000 r·min-1的速度離心2 min,丟棄上清液。接著,加入200 μL的漿蛋白提取試劑,搖勻后在冰浴中放置10 min。然后進行高速振蕩,4 ℃下以1.2×104r·min-1的速度離心10 min,取上清液(即細胞漿蛋白)備用。細胞核為沉淀物,加入50～100 μL的核蛋白提取試劑,高速渦旋15 s以確保充分分散,然后在冰浴中放置10 min。再次進行高速渦旋,4 ℃下以1.2×104r·min-1的速度離心10 min,取上清液(即細胞核蛋白)。

1.2.6Western blot檢測經過藥物處理的各組細胞,使用200 μL含有PMSF的RIPA裂解液在冰上裂解細胞10 min,然后以1.2×104r·min-1離心15 min。使用BCA法測量上清液的濃度。然后使用雙蒸水和5×上樣緩沖液將各組蛋白調至相同濃度,以100 ℃變性8 min。使用恒壓電泳將蛋白質分離,然后轉移到PVDF膜上。在室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h,然后在4 ℃下孵育一夜使用一抗(根據抗體說明書稀釋)或內參(GAPDH、Tubulin、Histone-H3)。使用TBST洗膜5 min,重復3次,然后在室溫下孵育兔二抗(1 ∶10 000稀釋)2 h。再次使用TBST洗膜3次,使用化學發光方法,全自動凝膠成像儀進行檢測,并用ImageJ軟件進行蛋白條帶的分析和處理。

2 結果

2.1 NaAsO2對PC12細胞中YAP蛋白核質分布的影響核質分離,檢測YAP蛋白核質分布,如Fig 1A所示,與control組相比,40 μmol·L-1NaAsO2組中YAP總蛋白的表達無變化,細胞質內的YAP蛋白表達明顯升高(P<0.05),而細胞核內YAP蛋白的表達明顯減少(P<0.01)。利用免疫熒光對YAP蛋白染色,如Fig 1B所示,control組的細胞核顯示較強的紅色熒光,胞質內熒光強度較弱;而NaAsO2處理后,細胞核中的紅色熒光減弱,胞質內熒光增強。

Fig 1 Effect of NaAsO2 on YAP protein in cytoplasmic and nucleus of PC12 cells detected by Western blot (A) and immunofluorescence (B)

2.2 XMU-MP-1抑制NaAsO2激活Hippo-YAP通路如Fig 2所示,與control組相比,40 μmol·L-1NaAsO2處理PC12細胞24 h后,Hippo-YAP信號通路中的p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表達以及p-LATS1/LATS1、p-YAP/YAP比值增加(P<0.01)。而經過XMU-MP-1(MST1/2抑制劑)預處理后,p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表達以及p-LATS1/LATS1、p-YAP/YAP比值相比于NaAsO2組均有所下調(P<0.05)。

Fig 2 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on expression of proteins associated with Hippo-YAP signaling pathway in PC12 cells

2.3 Hippo-YAP通路參與NaAsO2對PC12細胞周期的影響通過流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化,如Tab 1和Fig 3所示,與control組相比,XMU-MP-1對PC12細胞周期無影響。NaAsO2組G0/G1期細胞比例由control組的(63.80±0.69)%下降到(59.83±1.02)%(P<0.01),S期比例由control組的(17.25±1.09)%上升到(19.29±0.63)%(P<0.05),提示細胞周期被阻滯在S期。而XMU-MP-1預處理后,G0/G1期細胞比例由NaAsO2組的(59.83±1.02)%上升到(64.62±0.56)%(P<0.01),S期比例由NaAsO2組的(19.29±0.63)%下調到(16.71±0.31)%(P<0.01),可逆轉NaAsO2對S期的影響。

Tab 1 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on cell cycles

2.4 Hippo-YAP通路參與NaAsO2對PC12細胞凋亡的誘導利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率,如Fig 4所示, PC12細胞經NaAsO2處理24 h后,凋亡率由control組的3.83% 上升至11.00%(P<0.01),而XMU-MP-1預處理后,凋亡率由NaAsO2組的11.00%下降到6.88%(P<0.05)。然后,再利用Western blot檢測凋亡相關蛋白,如Fig 5所示,與control組相比,NaAsO2處理24 h后明顯下調BCL-2蛋白表達,上調BAX、P53蛋白表達(P<0.01)。而與NaAsO2組相比,XMU-MP-1預處理可以上調BCL-2蛋白表達,下調P53、BAX蛋白表達(P<0.05)。兩部分結果都表明,XMU-MP-1預處理可以部分逆轉NaAsO2誘導的細胞凋亡。

Fig 3 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on cell cycles of PC12 cells

Fig 4 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on apoptosis rates of PC12 cells

3 討論

研究顯示,砷暴露嚴重影響學習記憶、認知能力以及神經系統的發育[9]。課題組前期研究證明NaAsO2可抑制PC12細胞生長[10],促進細胞凋亡,并且干擾細胞周期,激活Hippo-YAP信號通路[7]。

Fig 5 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on expression of apoptosis-related proteins in PC12 cells

Hippo-YAP信號通路是一條高度保守的信號通路,可以對細胞增殖與凋亡進行調控。文獻報道,Hippo-YAP通路激活時,首先是MST1/2被磷酸化激活,然后MST1/2磷酸化LATS1/2,最終導致YAP蛋白磷酸化阻止其入核;而Hippo-YAP通路失活時,未磷酸化的YAP蛋白轉移至細胞核,然后與轉錄因子TEAD結合以誘導細胞生長和增殖相關的基因表達[5]。而用XMU-MP-1抑制MST1/2的活性可逆轉NaAsO2對Hippo-YAP通路的激活及對PC12細胞活力、形態及神經突觸相關蛋白的影響[8]。本次實驗還發現,NaAsO2激活Hippo-YAP通路后可抑制YAP蛋白入核,這可能是Hippo-YAP通路參與NaAsO2對PC12細胞生長的依據。

細胞周期分四個不同階段,DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)。毒性損傷會導致細胞周期檢查點的異常,使細胞周期停留在某一階段[11]。研究表明YAP蛋白可以促進B-MYB和FOXM1表達,并且誘導B-MYB與MuvB復合物在S期結合形成MMB亞復合物。MMB亞復合物招募FOXM1,在S/G2過渡期形成MMB:FOXM1復合物。進入G2期后,B-MYB被降解,FOXM1磷酸化激活促進G2/M期基因表達,使細胞進入M期[12]。研究發現,利用siRNA敲低YAP表達將導致WB-F344細胞(大鼠肝上皮樣干細胞)停滯在G0/G1期[13]。本課題組前期研究發現NaAsO2處理PC12細胞24 h后p-YAP表達和S期細胞比例均明顯增加,細胞阻滯在S期[7]。而用XMU-MP-1阻斷Hippo-YAP通路則逆轉NaAsO2誘導的S期阻滯,表明Hippo-YAP通路參與NaAsO2對細胞周期的影響。

BCL-2可抑制細胞凋亡,而BAX則促進凋亡的發生,當BAX/BCL-2的比例增加時,可促進細胞凋亡[14]。P53是腫瘤抑制基因,其編碼的P53蛋白可促進腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤發生[15]。Jin等[16]發現,YAP通過與TEAD相互作用并結合到BCL-2啟動子區域來上調BCL-2轉錄。前期研究發現NaAsO2能增加PC12細胞凋亡及P53、BAX蛋白表達而下調BCL-2的表達,提示NaAsO2可能通過促進YAP磷酸化阻礙其入核,來抑制BCL-2表達,從而促進PC12細胞凋亡。利用XMU-MP-1阻斷Hippo-YAP通路則逆轉NaAsO2對細胞凋亡、P53、BCL-2和BAX表達的調控,表明Hippo-YAP通路參與NaAsO2對細胞凋亡的影響。

綜上所述,本研究發現NaAsO2激活Hippo-YAP通路可改變YAP蛋白核質分布,而NaAsO2誘導細胞S期阻滯和促進細胞凋亡的內在機制可能涉及Hippo-YAP通路。然而,YAP如何進一步調控細胞周期,是否通過結合啟動子來調控凋亡相關蛋白表達,仍需要進一步實驗加以驗證。