白藜蘆醇通過EGFR/AKT/mTOR通路改善結(jié)直腸癌細(xì)胞伊立替康化療耐藥性

王 麗,龐 靜,沈 慧,寇茜睿,王玉玨,張 靜,李 芳

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 2. 延安大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科,陜西 延安 716000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是臨床上常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤,是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。晚期CRC一線化療藥物—伊立替康可通過結(jié)合DNA單鏈斷裂位點上的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ,形成伊立替康—DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ—DNA復(fù)合物,進(jìn)而使DNA單鏈斷裂轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈斷裂來抑制DNA復(fù)制,從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[2]。但部分CRC患者會出現(xiàn)獲得性耐藥,最終影響伊立替康的化療效果[3]。因此,深入探究IRI的耐藥機(jī)制并改善其化療耐藥性是目前CRC臨床治療亟待解決的關(guān)鍵問題之一。

白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種天然的植物抗毒素,廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等多種植物中;其不僅具有抗氧化和抗炎作用,還具有良好的抗腫瘤活性,在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移等階段均有一定的化學(xué)預(yù)防作用[4-5]。如RES可通過調(diào)節(jié)糖代謝重編程,在肝癌的癌前階段抑制二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞過度增殖[6]。RES可誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡,并抑制CRC細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進(jìn)程和干細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變,從而在CRC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用[7]。此外,RES還被證實能夠通過PI3K/AKT/mTOR通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的化療耐藥性[8]。但目前鮮有關(guān)于RES在CRC細(xì)胞IRI化療耐藥性調(diào)控中的作用及其分子機(jī)制的相關(guān)報道。另一方面,EGFR/AKT/mTOR信號通路在腫瘤進(jìn)展和放化療耐受性調(diào)控等方面扮演重要角色[9-11]。如CD109可通過激活EGFR/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移和化療耐藥[10]。TBMS1可部分通過抑制EGFR誘導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR/NF-κB信號通路活化來提高替莫唑胺耐藥膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的化療敏感性[11]。但RES能否通過下調(diào)EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細(xì)胞的IRI化療耐藥性目前尚未見報道。

本研究以CRC細(xì)胞系HT-29和RKO為研究對象,通過MTT實驗、克隆形成實驗及劃痕實驗等探究分析RES在CRC細(xì)胞增殖、遷移及IRI化療耐藥性方面的調(diào)控作用,并進(jìn)一步闡明RES通過下調(diào)EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細(xì)胞IRI化療耐藥性的相關(guān)分子機(jī)制。這對于提高CRC患者的化療效果并延長其生存期具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RES購自源葉生物(B20044);伊立替康購自Selleck(S5026);EGFR激活劑NSC 228155購自MCE(HY-101084);AKT激活劑SC79購自Selleck(S7863);AKT抑制劑MK2206購自碧云天(SF2712);MTT試劑購自索萊寶(M8180)。MMP2、MMP9、EGFR、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR等抗體均購自Proteintech,貨號分別為:10373-2-AP、10375-2-AP、51071-2-AP、66444-1-Ig、60203-2-Ig、67778-1-Ig、66888-1-Ig;β-actin抗體購自全式金生物(HC201-02)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)所用細(xì)胞均來自延安大學(xué)醫(yī)學(xué)研究實驗中心細(xì)胞庫。人CRC細(xì)胞系HT-29和RKO細(xì)胞分別用含10%胎牛血清的5A培養(yǎng)液與DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。除特殊說明外,均選取對數(shù)生長期的CRC細(xì)胞用于后續(xù)實驗。除特殊說明外,藥物處理濃度如下:HT-29細(xì)胞RES處理濃度為80 μmol·L-1,IRI處理濃度為10 μmol·L-1;而RKO細(xì)胞RES處理濃度為40 μmol·L-1,IRI處理濃度為2.5 μmol·L-1;且NSC 228155、SC79、MK2206的藥物處理濃度分別為2 μmol·L-1、10 μmol·L-1和2 μmol·L-1。

1.3 MTT實驗將細(xì)胞接種于96孔板中(HT-29細(xì)胞:3×103個/孔,RKO細(xì)胞:2.5×103個/孔),24 h后分別加入不同濃度的藥物,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于24 h、48 h、72 h時加入MTT試劑(20 μL/孔),37 ℃孵育4 h,酶標(biāo)儀檢測490 nm處A值,并計算細(xì)胞的存活率。

1.4 克隆形成實驗藥物處理48h后,將細(xì)胞以1×103個/孔的密度接種于12孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10 d。接著用PBS沖洗細(xì)胞2次,4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色30 min,沖洗、干燥并拍照。用500 μL DMSO溶解后,酶標(biāo)儀檢測570 nm處A值。

1.5 劃痕實驗將細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%～90%時,用10 μL移液器槍尖垂直劃線;PBS沖洗2次后,更換為含藥的1%胎牛血清培養(yǎng)基,記為0 h,拍照。藥物處理細(xì)胞24 h和48 h后,更換為新鮮含藥的1%胎牛血清培養(yǎng)基,拍照,計算細(xì)胞遷移率。

1.6 Western blot藥物作用48h后,用RIPA裂解液提取CRC細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白定量,取20 μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉等。一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1.5 h,加入ECL發(fā)光液曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 RES可改善CRC細(xì)胞的IRI化療耐藥性為探究RES與IRI對CRC細(xì)胞增殖的影響,分別用不同濃度梯度的RES和IRI處理人CRC細(xì)胞HT-29(RES:0、80、120、160、200、240 μmol·L-1;IRI:0、10、20、30、40、50 μmol·L-1)與RKO(RES:0、40、80、120、160、200 μmol·L-1;IRI:0、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1),采用MTT法檢測分析CRC細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果如Fig 1A-D所示,RES和IRI均可明顯抑制HT-29和RKO細(xì)胞增殖,且呈時間與劑量依賴性。經(jīng)GraphPad Prism 8軟件計算,RES作用于HT-29和RKO細(xì)胞的48 h半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為130.9 μmol·L-1和78.98 μmol·L-1,IRI作用于HT-29和RKO細(xì)胞的48 h半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為28.88 μmol·L-1和10.12 μmol·L-1。根據(jù)量效曲線,選取起效濃度RES 80 μmol·L-1聯(lián)合IRI 10 μmol·L-1作用于HT-29細(xì)胞,RES 40 μmol·L-1聯(lián)合IRI 2.5μmol·L-1作用于RKO細(xì)胞。MTT與克隆形成實驗結(jié)果表明,與對照組(DMSO處理組)相比,RES單藥處理組、IRI單藥處理組、RES與IRI聯(lián)合處理組的CRC細(xì)胞增殖能力均明顯降低,且RES與IRI聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖能力明顯低于IRI單藥處理組,提示RES可明顯增強(qiáng)IRI對CRC細(xì)胞能力的抑制作用(Fig 1E-G)。

接下來,通過劃痕實驗檢測分析了RES、IRI及這兩者聯(lián)合對CRC細(xì)胞遷移的影響。與對照組相比,RES單藥處理組、IRI單藥處理組及RES與IRI聯(lián)合處理組CRC細(xì)胞的遷移能力均明顯降低;且RES與IRI聯(lián)合處理組CRC細(xì)胞的遷移能力明顯低于IRI單藥處理組(Fig 2A,B)。與此一致,Western blot結(jié)果表明,與對照組相比,RES單藥處理組、IRI單藥處理組及RES與IRI聯(lián)合處理組CRC細(xì)胞中遷移標(biāo)志分子MMP2及MMP9的蛋白表達(dá)水平均明顯降低;且RES與IRI聯(lián)合處理組CRC細(xì)胞中這兩種蛋白的表達(dá)水平均明顯低于IRI單藥處理組(Fig 2C,D)。這些實驗結(jié)果表明,RES可明顯增強(qiáng)IRI對CRC遷移的抑制作用。綜上可得,RES能夠改善CRC細(xì)胞的IRI化療耐藥性。

Fig 1 RES combined with IRI inhibited proliferation of CRC

Fig 2 RES combined with IRI inhibited migration of CRC

2.2 RES通過EGFR/AKT/mTOR信號通路改善CRC細(xì)胞IRI化療耐藥性鑒于EGFR/AKT/mTOR信號通路在腫瘤化療耐藥中的重要作用,通過Western blot探究分析RES是否通過下調(diào)EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細(xì)胞IRI化療耐藥性。結(jié)果表明,相比于對照組,RES單藥處理組、IRI單藥處理組及RES與IRI聯(lián)合處理組CRC細(xì)胞中EGFR、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表達(dá)水平均明顯降低;且這些蛋白在RES與IRI聯(lián)合處理組CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯低于IRI單藥處理組(Fig 3A,B)。這些研究結(jié)果提示,RES可能通過下調(diào)EGFR/AKT/mTOR信號通路來抑制CRC細(xì)胞增殖和遷移,進(jìn)而改善其IRI化療耐藥性。

2.3 NSC 228155和SC79均可逆轉(zhuǎn)RES對CRC細(xì)胞IRI化療耐藥性的改善作用用EGFR激活劑(NSC 228155)、AKT激活劑(SC79)及AKT抑制劑(MK2206)進(jìn)一步驗證RES是否通過下調(diào)EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細(xì)胞的IRI化療耐藥性。這里共分為5個處理組:DMSO組、RES+IRI組、RES+IRI+NSC 228155組、RES+IRI+SC79組、RES+IRI+NSC 228155+MK2206組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RES+IRI+NSC 228155組與RES+IRI+SC79組CRC細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯高于RES+IRI組,而RES+IRI+NSC 228155+MK2206組CRC細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯低于RES+IRI+NSC 228155組(Fig 4A-C)。以上研究結(jié)果表明,NSC 228155與SC79均可逆轉(zhuǎn)RES對IRI化療耐藥性的改善作用,而MK2206能夠部分逆轉(zhuǎn)NSC 228155的這種作用。

3 討論

RES作為一種廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等多種植物中的天然有機(jī)化合物,除具有很好的抗炎、抗氧化作用,還被證實具有良好的抗腫瘤活性[4-5]。有研究表明,RES能夠以濃度依賴的方式來抑制CRC細(xì)胞HCT116 與SW480的增殖和集落形成[12]。與此一致,本研究發(fā)現(xiàn)RES可明顯抑制CRC細(xì)胞HT-29和RKO的增殖、遷移,表明其在CRC中具有良好的抗腫瘤活性。除抗腫瘤活性外,RES可能在腫瘤化療耐藥中也發(fā)揮了重要調(diào)控作用。據(jù)報道,RES不僅能夠逆轉(zhuǎn)甲狀腺未分化癌對多西他賽/阿霉素的繼發(fā)性耐藥,還可通過降低ADAM9的蛋白表達(dá)水平來抑制食管鱗狀細(xì)胞癌和肺癌細(xì)胞的遷移,且RES與達(dá)沙替尼、5-FU等臨床化療藥物聯(lián)用具有良好的協(xié)同抗癌作用[13- 14]。但目前鮮有關(guān)于RES在CRC細(xì)胞IRI化療耐藥中的調(diào)控作用及其分子機(jī)制的相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn),相比于IRI單藥處理組,RES與IRI聯(lián)合處理組CRC細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯降低,即RES可增強(qiáng)IRI對CRC細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。提示:RES能夠改善CRC細(xì)胞的IRI化療耐藥性,在CRC的臨床治療中具有很好的應(yīng)用前景。

Fig 3 RES ameliorated IRI chemoresistance of CRC cells through EGFR/AKT/mTOR

Fig 4 Both NSC 228155 and SC79 reversed ameliorating effect of RES on IRI chemoresistance of CRC

EGFR為受體酪氨酸激酶ErbB家族成員之一,其可通過激活下游AKT/mTOR信號通路參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的多個環(huán)節(jié),包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、血管生成及自噬等[15]。眾多研究證據(jù)表明,EGFR/AKT/mTOR信號通路激活在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及其放化療抗性中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[9]。但EGFR/AKT/mTOR信號通路在CRC細(xì)胞IRI化療耐藥性中的調(diào)控作用相關(guān)研究報道較少。研究表明,相比于非靶向脂質(zhì)體,運載IRI的EGFR靶向脂質(zhì)體在體內(nèi)外表現(xiàn)出更好的抗腫瘤活性[16]。IRI處理可使CRC細(xì)胞中MSH2蛋白表達(dá)水平上調(diào),反過來,MSH2表達(dá)上調(diào)又能夠減弱CRC細(xì)胞的CPT-11敏感性,而AKT信號通路已被發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié)這一過程[17]。與此一致,本研究結(jié)果表明,RES可通過下調(diào)EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細(xì)胞的IRI化療耐藥性。即與IRI單藥處理組相比,RES與IRI聯(lián)合處理組CRC細(xì)胞中EGFR、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表達(dá)水平均明顯降低,提示EGFR/AKT/mTOR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制。有趣的是,本研究發(fā)現(xiàn),RES不僅能下調(diào)AKT和mTOR的磷酸化水平,還能夠降低AKT及mTOR的總蛋白表達(dá)水平,從而抑制CRC細(xì)胞增殖遷移并改善其IRI化療耐藥性。這與姜黃素等其他藥物通過下調(diào)AKT和mTOR的磷酸化水平來發(fā)揮腫瘤抑制作用有所不同[18]。這些研究證據(jù)提示,RES通過EGFR/AKT/mTOR信號通路調(diào)控CRC細(xì)胞IRI化療耐藥性的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制可能比我們設(shè)想的更為復(fù)雜,接下來我們將對此展開更為深入的研究。而EGFR激活劑(NSC 228155)與AKT激活劑(SC79)均可逆轉(zhuǎn)RES對CRC細(xì)胞IRI化療耐藥性的改善作用,反之AKT抑制劑(MK2206)能夠部分逆轉(zhuǎn)EGFR激活劑的這種作用。這些研究結(jié)果表明,RES至少部分通過下調(diào)EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細(xì)胞的IRI化療耐藥性。

綜上,RES可能通過下調(diào)EGFR/AKT/mTOR信號通路來抑制CRC細(xì)胞增殖和遷移,進(jìn)而改善CRC細(xì)胞的IRI化療耐藥性。這為RES與IRI聯(lián)合治療CRC提供了堅實的理論基礎(chǔ),對于CRC患者化療效果的改善及其生存期的延長具有重要意義。