野黃芩素通過促進膽固醇外流途徑抑制巨噬細胞泡沫化的作用機制

吳若琳, 黃裕鴻, 王天琦, 孫文龍, 李敬達

(長江大學 1.生命科學學院、 2.農學院,湖北 荊州 434000;3. 山東理工大學生命與醫藥學院,山東 淄博 255000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種以膽固醇在動脈血管內膜過度沉積為主要病理特征的慢性血管類疾病,因其引發的血栓形成及動脈血管狹窄可直接導致冠心病、心肌梗死以及缺血性腦卒中等疾病的發生,故AS已成為威脅人類生命健康的重大疾病之一,探究其治療方法和新型藥物對于改善人類健康具有重要意義。大量研究表明,氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)所誘導的巨噬細胞泡沫化是AS發病過程中的關鍵起始環節[1]。在AS早期階段,巨噬細胞可通過其表面清道夫受體,大量攝取血管內膜組織中的oxLDL,并以膽固醇酯的形式存儲于細胞中[2]。另一方面,巨噬細胞還可通過三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)介導的膽固醇外流途徑,將膽固醇酯經載脂蛋白A1(apolipoprotein A-1,ApoA-1)及高密度脂蛋白外排至細胞外,以維持細胞內膽固醇的動態平衡[3]。然而,隨著oxLDL被巨噬細胞不斷攝入,膽固醇流入速率大于膽固醇外流速率,致使膽固醇代謝平衡被打破,造成膽固醇在細胞中過量積累,進而引發巨噬細胞泡沫化,最終導致AS斑塊形成并推動病情發展[2]。因此,抑制巨噬細胞泡沫化對改善AS意義重大。

目前,天然產物已成為新藥物先導結構的重要來源,并展現出較高的藥物開發價值。野黃芩素(Scutellarein)是一種黃酮類化合物,主要存在于黃芩、木蝴蝶、半枝蓮等多種中藥材中[4-5]。近年來研究發現,野黃芩素除了具有良好的生物利用度和抗氧化活性外,還在治療老年性癡呆癥、心腦血管疾病、中風后遺癥和癌癥等方面有明顯的療效[6]。既往研究發現,野黃芩素不僅具有較高的抗氧化活性[7],還可在LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞中,通過阻斷NF-κB和MAPKs通路發揮抗炎作用[8];此外,野黃芩素可通過抑制凝血酶及G蛋白偶聯受體活性減少血小板的黏附和聚集[9],并能夠阻止大鼠體內動脈或靜脈血栓的形成[10]。以上這些研究都表明,野黃芩素具有潛在的抗AS作用,但其是否能夠增強膽固醇外流途徑并抑制巨噬細胞泡沫化目前尚不清楚。為此,利用50 mg·L-1oxLDL,建立了THP-1巨噬泡沫細胞模型,旨在分析并闡明野黃芩素抑制巨噬細胞泡沫化的作用效果及潛在機制,為今后野黃芩素用于AS的臨床治療提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑野黃芩素(批號:S0327)、NBD標記膽固醇(批號:810250P)、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)(批號:79345)和羅格列酮(批號:R2408)均購自美國默克Sigma公司;總膽固醇(total cholesterol,TC)含量檢測試劑盒(批號:A110-1-1)購自南京建成生物工程研究所;抗His標簽抗體(批號:105327-MM02T)、人源ApoA-1重組蛋白(批號:10686-H02H)及人源PPARγ重組蛋白(批號:12019-H20B)均購自北京義翹神州科技有限公司;RIPA裂解液(批號:P0013B)、Lipo8000轉染試劑(批號:C0533)、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(批號:PG027)、pRL-TK對照載體(批號:D2760)及ECL化學發光試劑盒(批號:P0018S)均購自上海碧云天生物技術有限公司;PPARγ-siRNA及Scramble對照siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司;ABCA1抗體(批號:A7228)、PPARγ抗體(批號:A0270)、LXRα抗體(批號:A2141)、β-actin肌動蛋白抗體(批號:PKSH033261)及山羊抗兔二抗(批號:E-AB-1034)均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;PPRE報告基因載體(實驗室前期構建)。

1.2 儀器倒置顯微(德國徠卡公司);二氧化碳細胞培養箱(美國賽默飛世爾公司);多功能酶標儀(美國molecular devices公司);凝膠成像系統(美國伯樂公司);蛋白垂直電泳儀、蛋白轉膜儀(北京六一生物科技公司);低速臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾公司)。

1.3 方法

1.3.1THP-1細胞培養及巨噬化 人單核細胞株THP-1由武漢大學保藏中心提供。THP-1細胞解凍復蘇,接種于RPMI 1640完全培養基中(含有10 mmol·L-14-羥乙基哌口秦乙磺酸、1 mmol·L-1丙酮酸鈉、50 mmol·L-12-巰基乙醇、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105IU·L-1青霉素、0.1 g·L-1鏈霉素和10%熱滅活的胎牛血清),并置于37 ℃、5% CO2條件下懸浮培養。待細胞生長至70%密度時,1500 r·min-1離心5 min,收集細胞,并以1 ∶5的比例傳代培養。 傳代5次后,取對數生長期的細胞,使用含有PMA(160 nmol·L-1)的完全培養基處理24 h,以誘導細胞分化為巨噬細胞。

1.3.2MTT法檢測THP-1細胞存活率 將THP-1細胞以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板中,置于37℃、5% CO2條件下培養過夜。PMA誘導細胞巨噬化后(參照“1.3.1”),分別使用0.1%的DMSO作為空白對照組,用濃度為1、2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1野黃芩素(野黃芩素組)刺激細胞24 h。PBS清洗細胞后,參照檢測試劑盒使用說明,測定各組樣品的細胞存活率。

1.3.3細胞內TC含量的測定 將THP-1細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔板中,PMA誘導細胞巨噬化后,細胞分為空白對照組(DMSO 0.1%)、oxLDL組(50 mg·L-1)、oxLDL+野黃芩素組(5、10和20 μmol·L-1),參照TC含量檢測試劑盒使用說明,測定各組細胞的TC含量。

1.3.4THP-1巨噬細胞膽固醇外流速率的檢測 將THP-1細胞以每孔2.5×105個細胞的密度接種于24孔板中,PMA誘導細胞巨噬化后,細胞分為空白對照組(DMSO 0.1%)和野黃芩素組(5、10、20 μmol· L-1)預處理24 h后,用PBS洗凈細胞,使用含有0.2% BSA及50 mg· L-1ApoA-1的完全培養基孵育細胞6 h。分別收集細胞沉淀及上清液,并用RIPA裂解液裂解細胞沉淀。將上清液和細胞裂解液分別加入96孔黑板,并在469 nm激發波長及537 nm發射波長條件下,測定各組樣品中NBD的熒光強度。最終,細胞膽固醇外流的速率=上清液熒光強度/(上清液熒光強度+細胞裂解液熒光強度)。

1.3.5分子對接分析PPARγ與野黃芩素及羅格列酮的結合作用 從Protein Data Bank數據庫中下載PPARγ-LBD結構域的晶體結構(PDB ID: 5YCP),并利用ChemBio3D軟件構建野黃芩素及羅格列酮的PDB結構。分別對PPARγ-LBD晶體結構、野黃芩素和羅格列酮的PDB結構進行電荷分配、加氫去水、能量最小化等預處理操作,并分別利用AutoDock 4.2.6軟件包中的AutoGrid和Autodock模塊生成30×30×30 ?大小的對接網格和按照1 ∶1 的比例進行半柔性對接模擬分析。在對接過程中,PPARγ-LBD的晶體結構被設定為剛性,野黃芩素和羅格列酮的PDB結構被設定為柔性,對接方法為Lamarchian遺傳算法,其他參數均為默認值。對接結束后,利用PyMOL軟件繪制結合自由能最低的對接構象模型。

1.3.6ELISA法檢測PPARγ與野黃芩素及羅格列酮的結合活性 分為對照組(僅添加PBS)、羅格列酮組和野黃芩素組,將PBS、羅格列酮(5、10、20 μmol·L-1)及野黃芩素(5、10、20 μmol·L-1)以50 μL/孔分別加入96孔酶標板中,4 ℃條件下包被過夜后,使用1%明膠(100 μL/孔)封閉酶標板1 h,并于37 ℃條件下孵育PPARγ重組蛋白(20 mg·L-1, 50 μL/孔)1 h。隨后,各孔先后孵育抗His標簽抗體(1 ∶1 000)及HRP標記山羊抗兔二抗(1 ∶3 000),37 ℃條件下1 h,使用PBST(200 μL/孔)清洗酶標板4次。最后,用OPD顯色,并在492 nm處讀取吸光度值。

1.3.7雙熒光素酶報告基因檢測PPARγ的轉錄活性 將THP-1細胞以每孔2.5×105個細胞的密度接種于24孔板中,PMA誘導細胞巨噬化后,使用Lipo8000轉染試劑將PPRE報告基因載體(800 ng)及pRL-TK對照載體(200 ng)共轉染入細胞,具體方法參照Lipo8000轉染試劑使用說明。轉染36 h后,將細胞分為空白對照組(DMSO 0.1%)、羅格列酮組(5、10、20 μmol·L-1)和野黃芩素組(5、10、20 μmol· L-1),孵育24 h后,使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒先后測定細胞中海腎及螢火蟲熒光素酶的化學發光強度,并根據二者的比值計算各組細胞的PPARγ轉錄活性。

1.3.8Western blot檢測細胞內蛋白表達水平 將THP-1細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔板,并放置于37 ℃、5% CO2條件下培養過夜。PMA誘導細胞巨噬化后,細胞如“1.3.3”中分組處理,孵育24 h,收集各組細胞并用RIPA裂解液裂解后,利用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定裂解液中的蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品,加入上樣緩沖液,并放置于沸水浴中變性5 min。隨后,將各組蛋白樣品進行12% SDS-PAGE電泳分離,并將蛋白轉膜至PVDF膜。用5% 脫脂牛奶溶液封閉1 h后,將PVDF膜置于相關蛋白一抗稀釋液(1 ∶1 000)中,4 ℃條件下孵育過夜。TBST溶液清洗膜3次后,使用HRP標記山羊抗兔二抗(1 ∶3 000),室溫條件下孵育1 h。洗膜3次后,使用ECL化學發光試劑盒對膜進行顯影和拍照分析。

1.3.9siRNA介導的PPARγ基因沉默 將THP-1細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔板。PMA誘導細胞巨噬化后,將細胞分為scramble對照組和PPARγ沉默組,使用Lipo8000轉染試劑將scramble-siRNA(100 nmol·L-1)及PPARγ-siRNA(100 nmol·L-1)分別轉染入細胞,轉染24 h后,通過Western blot方法分析細胞模型中PPARγ的基因沉默效果。siRNA轉染后,使用DMSO(1%,對照組)及野黃芩素(20 μmol·L-1,野黃芩素組)分別刺激scramble-siRNA組及PPARγ-siRNA組細胞24 h,并分析各組樣品中LXRα、ABCA1蛋白表達及膽固醇外流速率的變化情況。此外,在研究PPARγ基因沉默對野黃芩素抑制巨噬細胞泡沫化的影響實驗中,siRNA轉染后,使用DMSO(1%)、oxLDL(50 mg· L-1)以及oxLDL(50 mg· L-1)與野黃芩素(20 μmol·L-1)的混合液分別刺激scramble-siRNA組及PPARγ-siRNA組細胞24 h,最后利用TC含量檢測試劑盒測定各組細胞的TC含量。

2 結果

2.1 野黃芩素通過增強膽固醇外流途徑抑制巨噬細胞泡沫化首先,通過MTT法分析不同濃度野黃芩素對THP-1巨噬細胞活力的影響。結果如Fig 1A所示,與空白對照組相比,1～20 μmol·L-1野黃芩素對THP-1巨噬細胞活力未產生明顯的抑制作用。然而,當野黃芩素劑量達到40、80 μmol·L-1時,THP-1巨噬細胞活力被明顯抑制。因此,5、10、20 μmol·L-1濃度的野黃芩素被認為是安全劑量,并被用于后續的藥物刺激實驗中。之后,本文分析了不同濃度野黃芩素對巨噬細胞膽固醇蓄積和外流作用的影響。結果如Fig 1B所示,與空白對照組相比,50 mg·L-1oxLDL處理24 h,可使細胞內膽固醇含量提高3.1倍,而野黃芩素的刺激作用可明顯抑制oxLDL誘導的膽固醇蓄積,并且該抑制作用呈現明顯的劑量依賴性。此外,野黃芩素還可通過劑量依賴的方式增強巨噬細胞的膽固醇外流速率(Fig 1C)。以上結果表明,野黃芩素可能通過加速膽固醇外流途徑阻止巨噬細胞的泡沫化。

2.2 PPARγ與野黃芩素及羅格列酮結合作用分析隨后,通過分子對接方法分析了野黃芩素及PPARγ化學合成型激活劑羅格列酮(分子結構如Fig 2A)與PPARγ-LBD結構域的結合情況。結果顯示,野黃芩素及羅格列酮均可插入至PPARγ-LBD結構域的T形配體結合區域(橙色區域);羅格列酮能夠與PPARγ的His-323及His-449形成兩根氫鍵(Fig 2D),野黃芩素可與PPARγ的Ser-289、His-323、His-449及Tyr-473形成四根氫鍵(Fig 2F),說明野黃芩素能與PPARγ結合;同時羅格列酮及野黃芩素與PPARγ-LBD結構域的對接結合自由能分別為-6.32 kcal·mol-1(Fig 2E)和-7.21 kcal·mol-1(Fig 2G),表明與羅格列酮相比,野黃芩素具有更低的結合自由能。以上結果提示,野黃芩素可結合PPARγ,且與羅格列酮相比其相互作用更為穩定。

Fig 1 Effects of scutellarein on cholesterol efflux and cholesterol accumulation of macrophages n=3)

Fig 2 Molecular docking analysis of binding of PPARγ to scutellarein and rosiglitazone

2.3 野黃芩素可結合并激活PPARγ的轉錄活性選取羅格列酮作為陽性對照,通過ELISA方法分析比較野黃芩素及羅格列酮與PPARγ重組蛋白的結合活性。結果如Fig 3A所示,野黃芩素能夠以濃度依賴的方式結合PPARγ重組蛋白。同時,在相同濃度條件下(5、10、20 μmol·L-1),野黃芩素的結合活性均明顯高于羅格列酮。進一步的雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示(Fig 3B),野黃芩素的刺激作用可按照濃度依賴的方式激活THP-1巨噬細胞中PPARγ的轉錄活性,并且在相同劑量下(5、10、20 μmol·L-1),其相比于羅格列酮具有更高的激活活性。以上結果證實,野黃芩素可結合PPARγ,并激活其轉錄活性。

Fig 3 Effect of scutellarein on binding and transcription activity of PPARγ n=3)

2.4 野黃芩素誘導LXRα和ABCA1的蛋白表達隨后,通過Western blot方法分析野黃芩素對LXRα和ABCA1蛋白表達的影響。結果如Fig 4所示,與對照組相比,野黃芩素的刺激可按照劑量依賴的方式明顯提升LXRα(Fig 4A)及ABCA1(Fig 4B)的蛋白表達,此結果提示野黃芩素可通過啟動LXRα-ABCA1信號通路增強巨噬細胞膽固醇外流途徑。

Fig 4 Effects of scutellarein on expression levels of

2.5 PPARγ基因沉默對野黃芩素降低TC含量、增強膽固醇外流速率和LXRα和ABCA1蛋白表達的影響為了進一步明確PPARγ在野黃芩素增強巨噬細胞膽固醇外流途徑中的作用,利用siRNA干擾技術,建立了PPARγ基因沉默巨噬細胞模型。如Fig 5A所示,與sramble-siRNA對照組相比,PPARγ-siRNA組細胞中,PPARγ蛋白表達水平下降約95%,表明PPARγ基因沉默細胞模型建立成功。隨后,使用20 μmol·L-1野黃芩素分別刺激sramble-siRNA和PPARγ-siRNA組細胞后發現,與sramble-siRNA對照組相比,PPARγ基因沉默可明顯抑制野黃芩素誘導的LXRα和ABCA1蛋白表達,并減弱了膽固醇外流途徑(Fig 5B-D)。此外,在PPARγ基因沉默細胞模型中,野黃芩素對巨噬細胞膽固醇蓄積的抑制作用也被明顯的逆轉(Fig 5E)。以上結果證實,野黃芩素可通過激活PPARγ-LXRα-ABCA1信號通路,增強膽固醇外流途徑,進而抑制巨噬細胞的膽固醇過度蓄積和泡沫化作用。

3 討論

巨噬細胞泡沫化是AS發病過程中的核心環節,其也被認為是導致AS斑塊形成以及血管狹窄的關鍵因素[1]。在AS早期階段,巨噬細胞可通過細胞表面清道夫受體大量攝取oxLDL,并引發細胞內膽固醇蓄積,進而導致巨噬泡沫細胞的形成[2]。隨著病情的發展,在炎癥和氧化應激的作用下, caspase信號通路介導的細胞凋亡作用被啟動,并導致巨噬泡沫細胞吞噬功能受損,從而使其無法清除血管內膜組織的細胞碎片。隨著細胞凋亡作用的加深,巨噬泡沫細胞發生繼發性壞死并不斷積累,并與遷入至內膜中的平滑肌細胞共同構成了AS斑塊核心,進而推動AS斑塊的形成[11]。在AS晚期,AS斑塊不斷生長、破裂,形成血栓導致動脈血管阻塞,最終導致各種心血管疾病及并發癥。膽固醇外流途徑是巨噬細胞防止自身膽固醇過度積累的重要代謝途徑,其可通過Apo-A1將膽固醇以高密度脂蛋白的形式轉運至肝臟進行循環和再利用,以維持細胞內膽固醇的代謝平衡[2],進而避免巨噬泡沫化細胞的形成。因此,增強膽固醇外流途徑對防治AS至關重要。

野黃芩素(4′, 5, 6, 7-四羥基黃酮)為野黃芩苷的苷元成分,主要分布于半枝蓮、燈盞細辛、木蝴蝶及黃芩等中藥材中[4]。近年來研究表明,野黃芩素具有抗炎、抗癌、抗氧化和保護神經等多種功效,并且相比于野黃芩苷,其還表現出更高的生物學利用度,因此具有較高的藥用開發價值[5]。近期的報道顯示,野黃芩素可通過調控血管內皮細胞的增殖以及炎癥作用來改善心腦血管功能[5],但其是否能夠增強膽固醇外流途徑并抑制巨噬細胞泡沫化目前尚不清楚。目前,PMA誘導的THP-1巨噬細胞被廣泛用于AS發病機制以及治療方法的研究,其也是建立巨噬泡沫細胞的理想材料[12]。為了探究野黃芩素對巨噬細胞泡沫化的影響,利用50 mg·L-1oxLDL,建立了THP-1巨噬泡沫細胞模型,并發現野黃芩素可明顯抑制oxLDL誘導的膽固醇過度蓄積。此外,野黃芩素的刺激作用還可加速巨噬細胞膽固醇外流途徑,提示野黃芩素能夠通過促進膽固醇外流途徑阻止巨噬細胞的泡沫化。

Fig 5 Effects of PPARγ knockdown on scutellarein-induced increase in cholesterol efflux and reduction in macrophage foam cell formation n=3)

過氧化體增殖物激活型受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ,PPARγ)作為一種配體激活型核轉錄因子,在巨噬細胞膽固醇逆轉運途徑中發揮了關鍵的調控作用[13]。研究顯示,PPARγ可被多種配體激活,并可與視黃醇類X受體α(retinoid X receptor α,RXRα)形成異源二聚體。該二聚體能夠通過結合順式作用元件PPRE,依次誘導下游肝X受體α(liver X receptor,LXR)及ABCA1的蛋白表達,進而加速巨噬細胞膽固醇外流途徑,并抑制巨噬細胞泡沫化作用[14]。動物研究結果表明,增強巨噬細胞PPARγ的轉錄活性可明顯減少AS斑塊的形成[15]。此外,Stemerman和Brunelleschi 的研究表明,PPARγ活化后還可通過抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的轉錄活性,減少炎癥因子的表達,進而降低了血管的炎癥反應和損傷作用[16]。由此可見,PPARγ的激活對于阻止巨噬細胞泡沫化和改善AS至關重要,其也成為治療AS的關鍵靶點。目前合成類PPARγ激動劑有羅格列酮及吡格列酮等藥物,但長期服用可導致患者水腫、體質量增加,甚至會產生心肌梗死的危險[17]。因此,從天然產物中尋找安全高效的PPARγ激動劑已成為當今AS研究的重點。

目前研究認為,PPARγ-LBD結構域中的T形活性口袋是PPARγ激活劑的主要結合部位[18],PPARγ激活劑與PPARγ-LBD之間的結合能越低,二者之間結合越穩定。為了進一步明確野黃芩素促進巨噬細胞膽固醇外流途徑的作用機制。本文分析了野黃芩素與PPARγ的相互作用。分子對接結果顯示,野黃芩素可插入至PPARγ-LBD結構域的T形活性口袋,與Ser-289、His-323、His-449及Tyr-473形成多個氫鍵,且相較于羅格列酮具有更低的結合自由能,提示野黃芩素能與PPARγ結合,并且結合更為穩定。ELISA、雙熒光素酶報告基因以及Western blot結果進一步證實,野黃芩素能結合PPARγ,并激活其轉錄活性。同時,野黃芩素的刺激作用還可上調PPARγ下游LXRα和ABCA1的蛋白表達,表明野黃芩素可誘導PPARγ活化。隨后,我們分析了PPARγ在野黃芩素提升巨噬細胞膽固醇外流途徑中的作用。基因沉默實驗結果表明,PPARγ基因沉默可明顯抑制野黃芩素誘導的LXRα和ABCA1蛋白表達,并減緩了膽固醇外流途徑。此外,在PPARγ基因沉默細胞中,野黃芩素對巨噬細胞泡沫化的抑制也被明顯減弱。以上顯示PPARγ密切參與了野黃芩素對巨噬細胞膽固醇外流途徑及泡沫化形成的調控作用。

綜上所述,野黃芩素可通過誘導PPARγ活化啟動LXRα-ABCA1信號通路,進而增強膽固醇外流途徑,最終阻止了巨噬細胞的泡沫化。本研究首次揭示了野黃芩素作為多種中藥的活性成分對巨噬細胞泡沫化作用的干預效果和潛在機制,這將為今后野黃芩素用于AS的臨床治療提供理論依據。由于時間及條件的限制,本研究僅在細胞水平上分析了野黃芩素對巨噬細胞泡沫化的影響,但是其是否能夠在動物水平上抑制巨噬細胞泡沫化,并阻止AS斑塊形成還需要進一步驗證。在今后的研究中,我們將構建AS小鼠模型,并在動物水平上驗證本文所得結論。