川芎多糖對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

趙威瑾,李 暢,李知娟,王 經,蘆曉囡

(邯鄲市中心醫院,河北 邯鄲 056008)

心肌缺血后再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)指急性心肌梗死后,冠狀動脈部分或完全阻塞,經過治療又重新再通,血管損傷反而呈短暫加重的病理生理現象。MIRI病理機制復雜,有研究報道氧化應激和炎癥反應在MIRI進展過程中發揮著重要作用[1-2]。

中醫沒有MIRI病名,根據其癥狀可歸屬“胸痹”“真心痛”等范疇,其病機在于“陽氣虧虛、痰瘀內阻”,宜采取“溫陽化氣、活血化瘀、祛痰化濁”等方案治療[3]。中藥川芎性溫味辛,歸肝、膽、心包經,具有活血行氣、祛風止痛等功效,常用于胸痹心痛、胸脅刺痛、經閉痛經、癥瘕腹痛等的治療。川芎多糖是中藥川芎的活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等藥理學作用[4-5]。趙玉等[6]研究顯示,川芎多糖通過抑制氧化應激和炎癥反應能夠有效減輕大鼠腦缺血再灌注損傷,但川芎多糖對MIRI的影響尚未見文獻報道。本研究構建MIRI大鼠模型并于造模前予川芎多糖預處理14 d,探討川芎多糖對大鼠MIRI的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:144只7周齡清潔級雄性SD大鼠由天津科德生物科技公司提供,動物許可證號:SCXK(津濱)2021-0001。大鼠于清潔環境分籠飼養,控制室溫23～25 ℃、相對濕度50%～70%、光照/黑暗12 h∶12 h。本研究經過邯鄲市中心醫院倫理委員會審批通過[倫理號:HDZXLL(K)字2022-009]。所有實驗動物相關操作嚴格遵循3R原則。

1.1.2 實驗藥物與試劑:川芎多糖(批號WKQ-0008433,四川維克奇);維拉帕米片(批號2111026,江蘇四環生物制藥);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、白細胞介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒(批號SEKR-0048、SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005,北京索萊寶);丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)分光光度法檢測試劑盒(批號BC0020、BC0170、BC4780,北京索萊寶);HE、TUNEL染色試劑盒(批號D006-1-1、G001-2-1,南京建成生物);高遷移率族蛋白B1(HMGB1)抗體、β-actin抗體、IgG二抗、ECL顯色液(批號bs-0664R、bs-0061R、bs-0294P、C05-07004,北京博奧森)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備與給藥:將144只大鼠隨機分為假手術組、模型組、維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組,每組24只。造模前14 d開始,維拉帕米組大鼠灌胃維拉帕米20 mg/(kg·d),川芎多糖低、中、高劑量組大鼠分別灌胃川芎多糖50、100、200 mg/(kg·d)[7]。末次給藥12 h后,除假手術組外,其余組大鼠參照文獻[8]通過夾閉冠狀動脈左前降支30 min構建MIRI大鼠模型。夾閉左前降支后心尖部位呈蒼白色、心電圖ST段抬高≥0.2 mV,提示存在心肌缺血;30 min后松開動脈夾恢復血流灌注,心尖部位變紅潤、ST段高度明顯回落,即可判定MIRI大鼠模型制備成功[9]。

1.2.2 超聲心動圖檢測大鼠心功能:再灌注2 h后,每組分別隨機取8只大鼠,麻醉后通過超聲影像系統檢測大鼠心功能,檢測指標包括左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室收縮末期內徑(LVEDs)、左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短分數(LVFS),每只大鼠測量3個心動周期取平均值。

1.2.3 心肌梗死面積:頸椎脫臼處死大鼠后開胸取心臟,0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,由心尖至心底橫向均勻切成5片,置于1% NBT染色液中37 ℃避光孵育30 min,運用Image J圖像分析軟件計算心肌梗死面積百分比,紫黑色為正常組織,蒼白色為梗死區。

1.2.4 心肌組織病變觀察及病理評分:另取每組8只大鼠處死取心臟,10%中性甲醛溶液中固定72 h,然后依次行脫水、浸蠟、4 μm厚度切片、烤片、脫蠟、透明等處理后,行HE染色,封片,光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理學改變。分別從出血、間質水腫、炎性浸潤、壞死4個方面進行評分[10],無病變計0分,病變面積占視野面積比例≤1/4計1分,1/4<病變面積占視野面積比例≤1/2計2分,1/2<病變面積占視野面積比例≤3/4計3分,4個方面評分之和即為病理評分。

1.2.5 心肌細胞凋亡情況及凋亡指數計算:取心肌組織石蠟切片,經脫蠟、透明等處理后,按照試劑盒操作說明行TUNEL染色,光學顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡狀況,細胞核黃褐色為陽性著色。每張切片隨機選取5個視野計數細胞總數和凋亡細胞數,凋亡細胞數所占百分比即為凋亡指數。

1.2.6 心肌組織生化指標檢測:取每組剩余的8只大鼠,處死后取心臟,取部分左心室心肌組織研磨勻漿,3500 r/min離心10 min取上清,遵照試劑盒說明采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6含量,分光光度法檢測MDA含量及SOD、CAT活性。

1.2.7 心肌組織HMGB1蛋白表達檢測:取左心室心肌組織100 mg,加1 ml RIPA裂解液冰上勻漿和裂解后提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度,10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白、轉膜、封閉1.5 h后,加一抗HMGB1、β-actin抗體4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育1 h,ECL顯影,通過蛋白條帶灰度值以β-actin為內參計算HMGB1相對表達量。

1.3 統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間多重比較采用LSD-t檢驗;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 見表1。模型組大鼠LVEDd、LVEDs明顯高于假手術組,LVEF、LVFS明顯低于假手術組(P<0.05)。維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組大鼠LVEDd、LVEDs明顯低于模型組,LVEF、LVFS明顯高于模型組(P<0.05),川芎多糖低、中、高劑量組間效應呈劑量依賴性(P<0.05)。與維拉帕米組比較,川芎多糖高劑量組大鼠LVEDd明顯降低,LVEF、LVFS明顯升高(P<0.05),兩組間LVEDs比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠心功能指標比較

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較 見表2(圖1)。模型組大鼠心肌梗死面積明顯高于假手術組(P<0.05)。維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組大鼠心肌梗死面積明顯低于模型組(P<0.05),川芎多糖低、中、高劑量組間效應呈劑量依賴性(P<0.05)。與維拉帕米組比較,川芎多糖高劑量組大鼠心肌梗死面積明顯降低(P<0.05)。

2.3 各組大鼠心肌組織病理學改變 見表3(圖2)。假手術組大鼠心肌纖維形態正常,細胞結構完整。模型組大鼠呈現心肌纖維斷裂、排列紊亂,細胞空泡樣變、壞死,核膜核仁邊界不清,間質區水腫、炎性細胞浸潤等病理學改變。與模型組比較,維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組大鼠心肌組織上述病變不同程度改善,川芎多糖低、中、高劑量組改善效果呈劑量依賴性,且川芎多糖高劑量組效果優于維拉帕米組。與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織病理評分明顯升高(P<0.05);與模型組比較,維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組大鼠病理評分明顯降低(P<0.05),川芎多糖低、中、高劑量組呈現劑量依賴性(P<0.05);與維拉帕米組比較,川芎多糖高劑量組病理評分明顯降低(P<0.05)。

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較 見表4(圖3)。假手術組大鼠心肌組織僅可見極少量散在的凋亡細胞。模型組大鼠心肌凋亡細胞數量較假手術組增多,凋亡指數較假手術組明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組大鼠心肌凋亡細胞數量不同程度減少,凋亡指數明顯降低(P<0.05),川芎多糖低、中、高劑量組效應呈劑量依賴性(P<0.05)。與維拉帕米組比較,川芎多糖高劑量組大鼠心肌凋亡細胞數量明顯減少,凋亡指數明顯降低(P<0.05)。

A:假手術組;B:模型組;C:維拉帕米組;D:川芎多糖低劑量組;E:川芎多糖中劑量組;F:川芎多糖高劑量組

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較(%)

2.5 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 見表5。模型組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯高于假手術組(P<0.05)。維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯低于模型組(P<0.05),川芎多糖低、中、高劑量組間效應呈劑量依賴性(P<0.05)。與維拉帕米組比較,川芎多糖高劑量組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(P<0.05)。

表5 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較(pg/ml)

2.6 各組大鼠心肌組織MDA含量和SOD、CAT活性比較 見表6。模型組MDA含量明顯高于假手術組,SOD、CAT活性明顯低于假手術組(P<0.05)。維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組MDA含量明顯低于模型組,SOD、CAT活性明顯高于模型組(P<0.05),川芎多糖低、中、高劑量組間效應呈劑量依賴性(P<0.05)。與維拉帕米組比較,川芎多糖高劑量組MDA含量明顯降低,SOD活性明顯升高(P<0.05),兩組間CAT活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表6 各組大鼠心肌組織MDA含量和SOD、CAT活性比較

2.7 各組大鼠心肌組織HMGB1蛋白表達比較 見表7(圖4)。模型組大鼠心肌組織HMGB1蛋白表達明顯高于假手術組(P<0.05)。維拉帕米組和川芎多糖低、中、高劑量組大鼠心肌組織HMGB1表達明顯低于模型組(P<0.05),且川芎多糖低、中、高劑量組間效應呈劑量依賴性(P<0.05)。與維拉帕米組比較,川芎多糖高劑量組大鼠心肌組織HMGB1表達明顯降低(P<0.05)。

A:假手術組;B:模型組;C:維拉帕米組;D:川芎多糖低劑量組;E:川芎多糖中劑量組;F:川芎多糖高劑量組

表7 各組大鼠心肌組織HMGB1蛋白表達比較

3 討 論

心肌缺血后再灌注損傷指冠狀動脈部分或完全急性阻塞后,重建血流后心肌反而出現進行性加重的損傷狀態[11-13]。川芎多糖是天然存在于中藥川芎的一類吡喃型多糖化合物,包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖等。本研究結果顯示,川芎多糖預處理可呈劑量依賴性降低LVEDd和LVEDs,提高LVEF和LVFS,改善MIRI大鼠心功能指標。HE染色和TUNEL染色結果顯示,川芎多糖可劑量依賴性抑制MIRI大鼠心肌纖維斷裂、排列紊亂,細胞空泡樣變、壞死,間質區水腫、炎性細胞浸潤等病變以及細胞凋亡,降低病理評分和凋亡指數。提示川芎多糖具有改善MIRI大鼠心功能、減輕心肌組織病變和細胞凋亡的作用。

氧化應激和炎癥反應是MIRI的重要病理機制之一,是導致缺血半暗帶細胞壞死或凋亡、增大梗死面積的重要因素[14-15]。研究發現,心肌缺血再灌注過程大量產生活性氧簇(ROS),大量消耗SOD、CAT等內源性抗氧化酶,破壞“ROS生成-還原清除”動態平衡而引發氧化應激損傷[16-17]。ROS可破壞血管內皮細胞,刺激TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子釋放而引發炎癥反應,TNF-α和IL-1β可刺激中性粒細胞等向損傷部位聚集并進一步分泌促炎因子,形成炎癥級聯反應,IL-1β能夠促進炎性細胞浸潤,從而加重炎癥損傷[18]。本研究結果顯示,川芎多糖可劑量依賴性抑制MIRI大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量升高和SOD、CAT活性降低。

HMGB1是一種核蛋白,在MIRI進展過程中發揮著重要調控作用。ROS可刺激HMGB1轉錄表達,并促進向ox-HMGB1型轉化,ox-HMGB1可通過激活NLRP3炎性小體而促進TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子釋放[19-20]。本研究結果顯示,川芎多糖可劑量依賴性抑制MIRI大鼠心肌組織HMGB1表達上調,川芎多糖高劑量組作用優于維拉帕米組。提示川芎多糖具有抑制MIRI大鼠心肌組織HMGB1表達的作用。

綜上所述,川芎多糖可改善MIRI大鼠心功能、減輕心肌組織病變和細胞凋亡。