固本活血壯骨顆粒通過Wnt/LRP5/β-catenin信號通路改善糖皮質激素性骨質疏松癥機制研究

吳 雪,張惜燕,李翠娟,張晉冀,周 潔,胡 勇

(1.陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046;2.空軍軍醫大學西京醫院,陜西 西安 710032)

糖皮質激素性骨質疏松癥(Glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)是由于長期或超劑量應用糖皮質激素類藥物所導致的以骨量減少、骨組織微結構退化、負重骨(腰椎、股骨)骨折率顯著增加為特征的代謝性骨病[1]?，F代研究發現,長期應用糖皮質激素治療的患者,第一年的骨丟失速率最快,應用時間超過6個月GIOP發病率可達50%,且骨量丟失與糖皮質激素使用時間與劑量呈正相關[2]。GIOP動物模型中可觀察到糖皮質激素對皮質骨與松質骨結構的破壞,其抑制骨外膜面的骨形成,促進骨內膜面的骨吸收,使皮質骨變薄,骨髓腔變大;另外,松質骨比皮質骨更容易受到影響,可見骨小梁的面積百分數減少、厚度變薄、數目減少、彼此間分離度增大[3]。Wnt信號通路是治療GIOP的潛在靶點之一,通過刺激成骨細胞增殖、分化與礦化,可糾正骨代謝負平衡狀態[4-6]。研究顯示,超劑量或長時間使用糖皮質激素可顯著降低成骨細胞Wnt16水平,增強Wnt信號通路的拮抗蛋白及復性調節因子Axin-2的表達,抑制成骨細胞分化,導致骨形成能力減弱及骨密度下降[7]。固本活血壯骨顆粒由7味中藥組成,包括黃芪、鹿角膠、淫羊藿、三七等,具有補腎健脾、活血壯骨之功效。課題組前期研究發現,固本活血顆粒通過調節多種信號通路改善絕經后骨質疏松癥、糖尿病性骨質疏松癥等[8-10]?；诖?本實驗通過對比大鼠骨組織微結構的變化,觀察固本活血壯骨顆粒對GIOP的作用并探究其機制,以期為GIOP的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:48只3月齡的雄性Wistar大鼠,體重為200～230 g,由成都達碩實驗動物有限公司提供,動物合格證號:SCXK(川)2020-030。

1.1.2 實驗藥物與試劑:固本活血壯骨顆粒(陜西中醫藥大學中藥制劑研究室制備);0.9%氯化鈉溶液(批號2B20011003,山東齊都藥業有限公司);阿法骨化醇軟膠囊(批號A48195,以色列梯瓦制藥工業有限公司);地塞米松注射液(批號1911052211,辰欣藥業股份有限公司)。低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5)與Runt相關轉錄因子2(Runx2)的RNA引物由擎科生物有限公司合成。

1.1.3 實驗儀器:Micro-CT掃描儀(型號Brukerskyscan1272,美國Bruker);PCR熒光定量儀(型號CFX96 Touch,美國Bio-Rad);倒置顯微鏡(型號DMi8M,德國Leica)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、造模與給藥:將大鼠隨機分正常組、模型組、西藥組、中藥組,每組12只。根據相關文獻描述,除正常組大鼠肌注0.9%氯化鈉溶液外,其余組大鼠按1 mg/kg的給藥劑量肌肉注射地塞米松以建立GIOP模型,2次/周,持續干預8周[11]。另外,本實驗藥物干預與造模同時進行:西藥組大鼠以阿法骨化醇軟膠囊溶液灌胃,給藥劑量為1 mg/kg;中藥組以固本活血壯骨顆粒(每1 g顆粒含生藥2 g)溶液灌胃,給藥劑量為4.68 g/kg(成人的6倍劑量);正常組、模型組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃,每周干預6 d,1次/d,持續干預8周。

1.2.2 Micro-CT掃描檢測大鼠骨微結構:依據文獻設置Micro-CT掃描參數后,對各組大鼠的右側股骨進行掃描和檢測[11]。實驗可得到骨礦物質密度(Bone mineral density,BMD)、結構模式指數(Structural model index,SIM)、各向異性程度(Anisotropic degree,DA)、骨小梁數量(Trabecular number,Tb.N)、皮質骨總面積(Total area of cortical bone,Tt.Ar)、皮質骨厚度(Cortical bone thickness,Ct.Th)、骨髓腔面積(Bone marrow cavity area,Ma.Ar),同時將獲得的圖像進行3D重建。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠骨組織病理學變化:待測骨組織需依次經過4%多聚甲醛溶液固定,脫鈣液(10%EDTA)脫鈣,石蠟包埋,切片,烘箱脫蠟脫水處理后,再進行HE染色,最后于顯微鏡下觀察骨組織形態學變化。

1.2.4 RT-PCR檢測通路相關分子的mRNA表達:各組大鼠的右側股骨組織經研磨處理后,以Trizol溶液提取組織總RNA,進行定量和反轉錄處理,并檢測LRP5、Runx2的mRNA表達;以β-actin為內參,采用2-ΔΔCt法對各組mRNA表達水平進行定量分析。LRP5上游引物:5’-CATCCAGCAGTTCATCCAGC-3’,下游引物:5’-CATGTTGTACAGGGAGGGT-3’。Runx2上游引物:5’-GCCGGGAATGATGAGAACTA-3’,下游引物:5’-GGACCGTCCACTGTCACTTT-3’。β-actin上游引物:5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’,下游引物:5’-TACATGGCTGGGGTGTTGA-3’。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件分析實驗數據。計量資料用均數±標準差表示,采用單因素方差分析法比較多組間的差異;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠股骨BMD比較 見表1。與正常組相比,模型組大鼠的BMD值降低(P<0.05);與模型組比較,西藥組、中藥組大鼠BMD值增高(均P<0.05);西藥組與中藥組大鼠BMD值比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠股骨BMD比較(g/cm3)

2.2 各組大鼠股骨組織病理形態學觀察 見圖1。正常組大鼠骨組織中骨小梁數量多,形態寬厚,結構完整,相互交織成緊密的網絡狀,伴少量脂肪細胞;與正常組比較,模型組大鼠的骨小梁數量明顯減少,厚度變薄變細,連續性中斷嚴重,且脂肪細胞堆積;與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠的骨小梁結構得到改善,表現為骨小梁的數量、厚度的顯著增加,骨小梁間隙以及脂肪空泡的顯著減少。

圖1 各組大鼠股骨組織病理形態學觀察(HE染色,×200)

2.3 各組大鼠股骨SIM、DA、Tb.N值比較 各組大鼠松質骨3D重建結果見圖2。正常組大鼠松質骨中骨小梁緊密交織成“絲瓜絡樣”網面結構;與正常組比較,模型組大鼠股骨骨小梁數目顯著減少,結構坍塌,呈顯著空洞樣;與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠的骨組織形態顯著改善,即骨小梁數目增多,連接較為緊密,空間結構破壞減少。骨小梁結構系數變化見表2。與正常組比較,模型組大鼠的SIM值增加,Tb.N降低(均P<0.05);與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠的SIM值降低,Tb.N值升高(均P<0.05)。各組大鼠DA值比較,差異無統計學意義(均P>0.05)。

圖2 各組大鼠股骨松質骨3D重建圖

表2 各組大鼠股骨SIM、DA、Tb.N值比較

2.4 各組大鼠股骨Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar值比較 各組大鼠皮質骨3D重建結果見圖3。正常組大鼠骨髓腔面積較小,皮質骨厚度較厚,結構無異常;與正常組比較,模型組大鼠股骨髓腔面積明顯增大,皮質骨厚度減小,孔隙增多,提示出現骨質疏松癥;在以阿法迪三與固本活血壯骨顆粒干預后,西藥組與中藥組大鼠骨髓腔面積變化不明顯,但皮質骨厚度均有明顯改善,此外,固本活血壯骨顆粒對大鼠皮質骨空隙增大的干預作用優于阿法迪三。各組大鼠皮質骨結構系數變化見表3。與正常組比較,模型組大鼠的Tt.Ar值、Ct.Th值降低,Ma.Ar值升高(均P<0.05);與模型組比較,西藥組、中藥組大鼠Tt.Ar值、Ct.Th值改善(均P<0.05)。西藥組、中藥組大鼠Ma.Ar值與模型組比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

表3 各組大鼠股骨Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar值比較

2.5 各組大鼠骨組織LRP5、Runx2 mRNA表達水平比較 見表4。與正常組比較,模型組大鼠骨組織LRP5、Runx2 mRNA表達降低(均P<0.05);與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠骨組織LRP5、Runx2 mRNA表達增加(均P<0.05)。

表4 各組大鼠骨組織LRP5、Runx2 mRNA表達水平比較

3 討 論

根據GIOP的臨床癥狀和體征,中醫學主要將其歸于“骨痿”“骨枯”等范疇[12]。糖皮質激素的長期過量應用損傷人體臟腑,其陽熱亢烈之性可發越腎氣,使腎失封藏,腎精得瀉,耗傷腎陰,久而及陽,正如《素問·痿論》所言:“腎者水臟也,今水不勝火,則骨枯而髓虛,故足不任身,發為骨痿”,其病因為“藥邪”,其發病機制為糖皮質激素引發機體陰陽失衡,病變關鍵在腎[13]。故GIOP的治療當以平調腎之陰陽為核心,采用補益腎精、健脾益氣、活血化瘀、通絡止痛等治法,補瀉兼施,以平為期[14]。固本活血壯骨顆粒組方契合GIOP的病因病機,方中淫羊藿、鹿角膠補益腎陽,龍骨、牡蠣滋陰潛陽,黃芪、三七益氣健脾、活血定痛,杜仲補益肝腎,強筋健骨,其中龍骨可于養陰的同時潛浮越之陽,煅牡蠣可于益陰的同時攝下陷之陽,二者相伍可益腎固精,防止腎失封藏;三七與龍骨、牡蠣相配伍可使祛瘀生新之力更強,促進新骨形成。

BMD為骨量評價指標[15-16]。本實驗以地塞米松作為刺激物建立骨質疏松癥模型,可見模型組大鼠BMD值降低;以固本活血壯骨顆粒干預后,大鼠BMD值提高,提示固本活血壯骨顆?？筛纳艷IOP大鼠骨量。GIOP不僅僅出現骨量的下降,還會伴隨松質骨微結構破壞、皮質骨多孔性改變。因此,為更全面的了解固本活血壯骨顆粒對GIOP大鼠的干預機制,本實驗通過Micro-CT技術獲得皮質骨與松質骨測量參數。SIM、Tb.N、DA為松質骨結構指標,分別代表結構模式指數、骨小梁數量以及各向異性程度;Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar為評價皮質骨質量的測量學指標,分別代表著皮質骨總面積、皮質骨厚度以及骨髓腔面積[3,17]。骨質疏松癥后常見Ct.Th、Tb.N降低,DA、Tt.Ar、SIM、Ma.Ar升高[17]。本實驗中,給予固本活血壯骨顆粒干預后,大鼠的Ct.Th、Tb.N、Tt.Ar和SIM值均得到改善;Ma.Ar值稍有變化,但差異無統計學意義;在一定程度上說明固本活血壯骨顆粒對GIOP大鼠松質骨微結構與皮質骨是具有改善作用的。

Wnt/LRP5/β-catenin是調控骨平衡狀態的重要信號通路,該通路的激活有利于骨形成[18]。LRP5、GSK-3β、β-catenin、Runx2等是該信號通路的主要構成部分[19]。Wnt/LRP5/β-catenin信號通路被觸發時,Wnt與由Frizzled受體和LRP5組成的受體復合物結合,使β-catenin在細胞質內不斷聚集,最終轉移到細核內與 LEF1/TCF轉錄因子結合,激活下游靶基因Runx2及OSX,促進其轉錄與翻譯,以達到維持細胞存活、分化與增殖的目的[20]。本實驗中,以地塞米松復制GIOP模型,可見LRP5與Runx2的mRNA表達均減少,提示Wnt/LRP5/β-catenin信號通路被抑制;與模型組比較,西藥組與中藥組大鼠LRP5、Runx2 mRNA表達均增加,且兩組LRP5、Runx2 mRNA表達比較差異無統計學意義,說明固本活血壯骨顆粒與阿法骨化醇軟膠囊可提高LRP5活性,增加β-catenin穩定性,并促進其轉移至核內,促進下游靶基因Runx2表達,以激活Wnt/LRP5/β-catenin信號通路。另外,HE染色結果證實,固本活血壯骨顆粒與阿法骨化醇軟膠囊干預后,GIOP大鼠的骨小梁數量變多,間隙變小,連續性增強。

綜上所述,固本活血壯骨顆粒能夠提高GIOP大鼠BMD,改善骨小梁微結構,保護皮質骨與松質骨,其作用機制與調節Wnt/LRP5/β-catenin信號通路有關。