不同頻率電針對前交叉韌帶損傷家兔脊髓組織突觸相關蛋白及神經遞質的影響

蘇 虹,黃永原,張鵬翼,韋業騰,徐照琳,楊雪捷,李嘉英,王晨璽

(廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530200)

前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament,ACL)損傷是常見的膝關節損傷之一,臨床表現為疼痛、腫脹、膝關節活動受限及不穩,常伴隨膝關節慢性疼痛,極大地降低患者的生活質量[1-2]。外周敏化和中樞敏化是介導慢性疼痛的主要機制。ACL局部受損后釋放促炎因子,造成周圍神經的炎性浸潤,增強傷害性感受器神經對傳入信號的敏感性,表現為外周致敏[3]。持續性外周傷害性刺激可引起脊髓釋放興奮性神經遞質,促使脊髓神經根及突觸傷害性感受神經元過度興奮,產生中樞敏化[4]。中樞敏化不僅繼發于外周敏化,也可增強外周敏化。突觸是維持中樞神經系統穩定的基礎,神經功能穩定依靠突觸功能及結構可塑性維持。研究發現,慢性疼痛模型大鼠的脊髓背角內突觸活性區面積增大、突觸囊泡數量增多、突觸后致密物增厚等突觸結構可塑性的改變,抑制性神經遞質減少或興奮性神經遞質增加,突觸可塑性變化可引起中樞痛敏[5-6]。以上提示,調節脊髓可塑性可能是改善ACL損傷慢性疼痛的關鍵機制。既往研究已證實電針可通過促進軸突再生、調節脊髓突觸可塑性以及中樞神經遞質釋放,從而起到鎮痛作用[7-8]。電針被廣泛應用于膝關節疼痛、腫脹及功能障礙的治療,但比較不同電針頻率療效的實驗研究鮮有報道。基于此,本研究通過建立ACL損傷家兔模型,觀察不同頻率電針對ACL損傷家兔背根神經節(DRG)中突觸可塑性相關蛋白突觸素(SYN)、突觸后致密蛋白95(PSD95),神經遞質谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)及疼痛介質前列腺素E2(PGE2)、P物質(SP)的表達,揭示電針干預ACL損傷的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:同批次、3月齡健康新西蘭兔24只,雄性,體重為(2.5±0.5)kg,由長沙市天勤生物公司提供[動物生產許可證號:SCXK(湘)2019-0015]。

1.1.2 實驗試劑:高效RIPA組織/細胞裂解液(R0010,Solarbio);BCA法蛋白濃度測定試劑盒(PC0020,Solarbio);ECL化學發光底物(BL523A,Biosharp);PAGE膠促凝劑(T8090,Solarbio);磷酸化蛋白酶抑制劑(G2007-1ML,Servicebio);PVDF膜(G6015-0.45,Servicebio);HRP標記山羊抗兔(GB23303,Servicebio);GAPDH一抗(BL006B,Biosharp);PSD95試劑盒(AF5283,Affinity);SYN試劑盒(AF0402,Affinity);GABA試劑盒(SP25998,武漢賽培生物科技有限公司);Glu試劑盒(SP26620,武漢賽培生物科技有限公司);SP酶聯免疫分析試劑盒(JYM0187Rb,基因美);PGE2酶聯免疫分析試劑盒(RB70049,Bioswamp)。

1.1.3 實驗儀器:酶標分析儀(HBS-1096A,德鐵);低溫離心機(5418R,eppendorf);低溫離心機(5418R,eppendorf);多功能酶標儀(INFINITE 200PRO,TECAN);水平搖床(TS-3D,其林貝爾);電泳儀(PowerPac Basic,Bio-Rad);凝膠成像系統(Tanon 5200,上海天能);高速低溫組織研磨儀(KZ-III-F,Servicebio)。

1.2 實驗方法

1.2.1 家兔ACL損傷模型制備:建立兔膝關節ACL損傷模型[9]。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥(30 mg/kg)深度麻醉,將其固定于手術臺上,剃去膝關節區毛發,消毒后鋪上無菌單。沿著左髕骨內側做縱行手術切口,長2～3 cm。切開皮膚后仔細分離筋膜、肌肉,充分暴露關節腔。在ACL實質部將其完全橫斷并做2 mm 缺損,沖洗關節腔后逐層縫合,關閉切口,加壓包扎。手術后單籠飼養,肌肉注射青霉素鈉(4萬U/kg)每日1次,連續1周。韌帶損傷模型由同一位外科醫生完成,以保證各組動物造模的規范化和一致性。

1.2.2 實驗動物分組與干預:將24只家兔適應性飼養1周后,隨機取6只作為空白組,剩余18只造模成功后隨機分為模型組、低頻電針組和高頻電針組,每組6只。造模后1周開始治療。空白組、模型組:與其他組家兔同時抓取、固定,不進行電針干預。低頻電針組:選取患側血海、梁丘穴,穴位定位參照《實驗針灸學》家兔常用針灸穴位定位標準并以解剖學為依據。穴位皮膚以碘伏常規消毒后,選用華佗牌28號1寸一次性無菌針灸針直刺進針,針刺深度為0.5～0.8 cm,在針柄處連接G-6805型電針治療儀,連續波,頻率為2 Hz,留針20 min。每日治療1次,連續治療21 d。高頻電針組:取穴及針刺深度同低頻電針組。針柄處連接G-6805型電針治療儀,連續波,頻率為100 Hz,留針20 min。每日治療1次,連續治療21 d。

1.2.3 取材:干預結束后,耳緣靜脈注射過量3%戊巴比妥處死全部家兔。快速暴露,并取出L2～S1背根神經節,用0.9%氯化鈉溶液洗滌后置入5 ml凍存管,放入-80 ℃冰箱中保存,用ELISA和Western blot法檢測相關指標。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況:觀察每組家兔精神狀態、體毛及膝關節腫脹、活動度、步態等情況變化。

1.3.2 機械刺激縮足閾值:分別于造模后第7、28天采用Von-Frey痛閾測量儀測量家兔痛閾值。將家兔放進底部為鋼絲網的籠子中,待其適應10 min,完全平靜后進行測量。使用Von-Frey痛閾測量儀的纖維刺激針頭刺激家兔左側后肢足底中部,刺激強度逐漸增加,測量過程中密切觀察痛閾測量儀的數值變化,直至家兔出現縮足反應則記錄相對應的讀數即為Von-Frey閾值。最大為180 g,若大于180 g則記為180 g。每次測量間隔約5 min,連續測量3次,取平均值。

1.3.3 ELISA法檢測L2～S1背根神經節中PGE2、SP、Glu、GABA表達:將L2～S1背根神經節從-80 ℃冰箱中取出,置于室溫平衡30 min。根據ELISA試劑盒說明書進行操作,采用酶標儀讀取450 nm處吸光度(OD)值,繪制標準曲線并計算PGE2、SP、Glu、GABA含量。

1.3.4 Western blot法檢測L2～S1背根神經節中突觸可塑性相關蛋白SYN、PSD95表達:稱取50 mg L2～S1背根神經節組織剪碎,加入RIPA裂解液后混勻,4 ℃冰箱過夜裂解,離心后收取上清液測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠,加入相應體積的總蛋白樣品與4×蛋白質上樣緩沖液,95 ℃變性10 min,電泳后轉膜至PVDF膜,室溫封閉2 h;用PBS稀釋一抗(稀釋比例為1∶1300),將封閉后的膜直接放入一抗工作液中,4 ℃反應過夜。PBST洗膜3次,每次10 min。PBST稀釋二抗(稀釋比例1∶3000),將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中,作用90 min,PBST洗膜3次,曝光及洗片,將膠片掃描后,用Image J軟件測定條帶灰度值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差表示,符合方差齊性,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗;等級資料多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組家兔干預前后一般情況及行為學比較 造模前,各組家兔健康狀況良好,進食、飲水正常,毛色有光澤,步態正常,反應靈敏,活動度可。造模后1周,模型組、低頻電針組、高頻電針組家兔左側后肢輕度外翻,收縮減少,爬行時間增長時可見右后足受力,伴有跛行、拖步,膝關節腫脹,活動度較前明顯受限;空白組家兔無明顯活動受限及步態異常。干預治療后,低頻電針組、高頻電針組家兔膝關節腫脹、活動度、步態等明顯改善;模型組家兔膝關節附著肌肉萎縮伴僵硬,多蜷縮于籠子角落,爬行時右后足受力,跛行、拖步加重,活動減少,精神欠佳;空白組家兔未見明顯異常。

2.2 各組家兔干預前后機械痛閾值比較 見表1。干預前,與空白組比較,模型組、低頻電針組、高頻電針組家兔機械痛閾值降低(均P<0.01);模型組、低頻電針組、高頻電針組家兔機械痛閾值比較差異無統計學意義(均P>0.05)。干預后,模型組家兔機械痛閾值較前降低(P<0.01);與模型組比較,低頻電針組、高頻電針組家兔機械痛閾值顯著升高(均P<0.01);低頻電針組較高頻電針組機械痛閾值升高(P<0.01)。

表1 各組家兔干預前后機械痛閾值比較(g)

2.3 各組家兔背根神經節中PGE2、SP表達比較 見表2。干預后,與空白組比較,模型組、高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經節中PGE2、SP的表達水平升高(均P<0.01);高頻電針組、低頻電針組家兔PGE2、SP表達低于模型組(均P<0.01),且低頻電針組低于高頻電針組(P<0.05)。

表2 各組家兔背根神經節中PGE2、SP表達比較(pg/g)

2.4 各組家兔背根神經節中Glu、GABA表達比較 見表3。干預后,與空白組比較,模型組、高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經節組織Glu的表達水平升高(均P<0.01),高頻電針組、低頻電針組Glu表達低于模型組(均P<0.01),且低頻電針組低于高頻電針組(P<0.01);與空白組比較,模型組、高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經節GABA的表達水平降低(均P<0.01),高頻電針組、低頻電針組GABA表達高于模型組(均P<0.01),且低頻電針組高于高頻電針組(P<0.05)。

表3 各組家兔背根神經節中Glu、GABA表達比較(μmol/g)

2.5 各組家兔背根神經節中PSD95、SYN表達比較 見表4(圖1)。干預后,與空白組比較,模型組、高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經節中PSD95、SYN的表達水平升高(均P<0.01),高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經節中PSD95、SYN表達低于模型組(均P<0.01),且低頻電針組低于高頻電針組(P<0.05)。

圖1 各組家兔背根神經節中PSD95、SYN表達電泳圖

表4 各組家兔背根神經節中PSD95、SYN表達比較

3 討 論

ACL損傷后免疫活化介導炎癥級聯反應,引起損傷局部痛覺感受器敏化,傷害性感受信號經感覺神經纖維傳導至脊髓背角,脊髓中樞將信號調質和放大傳遞至丘腦和大腦皮層[10-12]。外周持續刺激導致脊髓背角神經元突觸重塑,突觸閾下沖動匯聚到傷害感受性神經元,誘發或放大動作電位,引起中樞敏化。ACL損傷在中醫屬“膝痹”范疇,主要病機為筋脈受損,氣血不暢。血海、梁丘位于膝關節周圍,具有通利關節之功,分屬脾、胃兩經,可補養氣血以濡養筋骨。多項臨床研究指出,電針可通過減輕炎癥浸潤,緩解疼痛和膝關節腫脹[13-14]。再者,電針可促進受損神經修復再生,調節神經肌肉功能,改善膝關節活動功能[15-16]。

隨著ACL損傷病程遷延,傷害性突觸信息持續傳遞,脊髓背角神經元做出適應性功能或結構調整,導致疼痛長時程增強,誘發閾下疼痛,導致中樞敏化。SP、PGE2參與脊髓水平的痛覺信息轉導[17]。GABA和Glu作為中樞神經系統內主要的抑制性、興奮性神經遞質,在痛覺環路中起到關鍵作用[18]。機體組織受損后,脊髓背角將痛覺信號傳遞至中樞,突觸前膜囊泡中的Glu釋放增多,GABA釋放減少,興奮突觸后神經元,增強痛覺信息傳遞[19-20]。中樞敏化與脊髓可塑性密切相關,突觸可塑性是脊髓可塑性的主要表現[21]。其中,中樞敏化、持續性外周刺激亦可引起脊髓突觸功能、結構形態、數量及傳遞效能的變化[22-23]。調節突觸可塑性可促進神經發育再生,參與神經環路重建[24]。SYN、PSD95分別是突觸前膜和突觸后膜的可塑性蛋白,主要通過影響突觸的功能結構、調節神經遞質分泌、維持突觸膜結構穩定性,進而調節突觸可塑性[25]。既往研究發現電針可通過下調SYN、PSD95表達,改善脊髓背角神經元突觸超微結構,緩解神經根型頸椎病大鼠脊髓節段中樞敏化,起到鎮痛作用[26]。此外,電針可改善疼痛模型大鼠脊髓背角的GABA能神經元功能[27];針刺可升高膝骨性關節炎患者右側丘腦GABA水平,進而起到鎮痛作用[28]。再者,有學者證實電針可抑制頸部切口痛大鼠脊髓頸段背側區mGluR5蛋白及mRNA表達,升高GABA1R蛋白表達,進而產生鎮痛效應[25]。

本研究發現,ACL損傷后家兔機械痛閾值降低,背根神經節中的SP、PGE2表達升高,興奮性神經遞質Glu表達升高,抑制性神經遞質GABA表達降低,提示ACL損傷可引起背根神經節中的致痛因子表達升高,痛覺信號傳遞至中樞,引起Glu釋放增多,GABA釋放減少,導致中樞敏化。為了進一步觀察ACL受損后脊髓可塑性變化,對DRG中的突觸可塑性蛋白SYN、PSD95進行檢測,發現模型組家兔的SYN、PSD95表達明顯下降。經電針干預后,背根神經節中的SP、PGE2降低,疼痛及行為學較前改善,此外,Glu表達較模型組減少,GABA表達較模型組升高,低頻電針組家兔均優于高頻電針組。電針干預后,背根神經節中的SYN、PSD95表達增多,提示電針可提高突觸蛋白數量,調節脊髓功能或結構可塑性,說明電針可通過調節脊髓可塑性減輕中樞敏化。

在不同腦區或核團間相互作用影響下,大腦中神經元活動的實時整合,參與維持了疼痛。島葉、扣帶回、前額皮質、丘腦、脊髓等大腦結構均參與了痛覺信息產生,我們可通過多模式核磁及腦電信息數據采集,觀察電針治療在ACL損傷患者腦網絡神經應答模式調節情況。疼痛與涉及情感和動機的神經結構功能異常密切相關,可以圍繞“大腦獎賞環路及相關分子機制”,展開針刺改善疼痛共病負性情緒的實驗研究。