通心絡膠囊調控轉化生長因子-β1表達改善糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化損傷機制研究

閆文瑞,張常喜,張曉晉,張亞平,張雄慧

(1.寧夏醫科大學中醫學院,寧夏 銀川 750001;2.寧夏中醫醫院暨中醫研究院肺病科,寧夏 銀川 750021;3.甘肅中醫藥大學中醫學院,甘肅 蘭州 730020)

糖尿病(Diabetic mellitus,DM)的發病率及致死率逐年上升,其臨床主要表現為代謝紊亂,受飲食、運動及壓力多方面影響,血糖常常控制不佳,隨病程發展病變逐漸累及機體各系統及器官。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病心血管慢性并發癥之一,在疾病晚期極易進展為不可逆的心肌纖維化病變,且高血糖持續時間與心肌纖維化程度呈正相關[1]。DCM表現為心肌灌注和功能障礙,屬于特殊心肌病,長期高血糖和胰島素抵抗可引起心肌能量代謝異常、心肌纖維化、左心室肥厚、冠狀動脈功能和舒張障礙等[2-3]。心肌間質和血管周圍的纖維化是DCM的主要病理特征。心肌纖維化作為心臟重塑的一種明顯結構特征,表現為間質細胞過度增殖,膠原纖維在心肌組織結構中過量積聚,各型膠原成分發生改變、比例失衡等[4]。研究表明,心肌纖維化與糖尿病的住院率及病死率相關[5],因此尋找心肌纖維化新的治療靶點具有重要意義。近年來研究表明,DCM的發生發展與轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的異常表達和活化密切相關[6-7]。糖尿病患者長期高血糖及代謝紊亂均可刺激TGF-β1分泌,TGF-β1可促進心肌成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原分泌,誘導心肌纖維化[8]。因此,抑制TGF-β1活化對于改善心肌纖維化程度有重要作用。“大凡經主氣,絡主血,久病血瘀”,消渴病基礎病機為氣陰兩虛,久病必入血絡;消渴纏綿不愈轉歸心肌病變與絡病病變相符。中藥復方制劑通心絡膠囊蘊含著中醫學“絡病”理論,其治則核心重在營衛,營衛不通,血凝不流;亦如《難經》云:“損其心者,調其營衛”。通心絡膠囊具有益氣活血、通絡止痛之效。眾多臨床研究表明通心絡膠囊在臨床治療DCM具有延緩病情進展、改善心功能的作用[9-10]。本研究觀察通心絡膠囊對DCM大鼠心肌纖維化的作用,以期為中醫藥防治DM心肌纖維化提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:雄性SPF級SD大鼠共48只,6～8周齡,體重為(200±20)g,均購于寧夏醫科大學實驗動物中心,許可證編號:SCXK寧2020-0001。大鼠飼養于溫度(25±1)℃、濕度50%的標準通風環境,普通飼料適應性喂養1周。本實驗由寧夏醫科大學動物實驗倫理委員會審核批準(倫理編號IACUC-NYLAC-2020-039)。

1.1.2 實驗藥物與試劑:通心絡膠囊(批號Z19980015);纈沙坦膠囊(批號H20040217)。鏈脲佐菌素(美國Sigma公司);HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒(批號G1120、G1340,北京Solarbio公司);TGF-β1抗體(批號A2124,武漢ABclonal公司);TGF-β1 ELISA試劑盒(批號ml002856V,上海酶聯生物);封閉用羊血清工作液、通用二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒(批號ZLI-9056、PV-9000、ZLI-9017,北京中杉金橋生物技術有限公司);普通飼料及高脂飼料(北京博愛港生物技術有限公司)。

1.1.3 主要實驗儀器:正置顯微鏡(型號DM3000,德國徠卡);生物組織石蠟包埋機(型號YB-6LF,湖北亞光);切片機(型號RM2245,德國徠卡);電熱恒溫培養箱(武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司);離心機(型號TG16W,長沙湘智離心機儀器有限公司);冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);酶標儀(深圳Rayto公司);電泳儀、電泳槽、轉膜儀(美國伯樂公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠分組與模型制備:按照隨機數字表法將48只SD大鼠分為對照組、模型組、纈沙坦組及通心絡高、中、低劑量組,每組8只。模型組、纈沙坦組及通心絡高、中、低劑量組構建DCM模型:適應性喂養結束后禁食12 h開始實驗,高糖高脂飼料喂養,以鏈脲佐菌素 30 mg/kg一次性腹腔注射建立DCM模型。2周后使用羅氏血糖儀檢測大鼠血糖水平,隨機尾靜脈血漿葡萄糖濃度>16.7 mmol/L,且出現多飲、多食、多尿癥狀,認為糖尿病模型造模成功。繼續造模處理至第8周,篩選符合實驗標準的大鼠。以普通飼料喂養對照組大鼠,并與模型組等量一次性腹腔注射枸櫞酸鹽緩沖液。

1.2.2 給藥:造模成功后,根據人與大鼠之間用藥劑量換算公式計算給藥劑量。纈沙坦組大鼠予纈沙坦膠囊(30 mg/kg),通心絡低、中、高劑量組大鼠分別給予0.25、0.5、1.0 g/kg通心絡,對照組和模型組大鼠予等體積0.9%氯化鈉溶液,各組均連續干預4周。在實驗周期12周內未發現大鼠酮癥酸中毒表現者。

1.2.3 大鼠一般情況:實驗期間密切觀察并記錄大鼠攝食、飲水、排尿排便及精神狀態等情況,及時監測大鼠體重及血糖值變化。

1.2.4 大鼠心肌組織HE染色:干預結束后,大鼠禁食不禁水12 h,給予10%烏拉坦0.4 ml/kg腹腔注射進行麻醉,沿胸骨正中線打開胸腔,取出完整心臟組織,剪取大鼠左心室作為標本,心臟組織脫水、石蠟包埋、切片脫蠟后,進行蘇木素、伊紅染色,最后脫水并使用中性樹脂封片,置于通風櫥內晾干,光鏡下觀察心肌組織病理形態并采集圖片。

1.2.5 大鼠心肌組織Masson染色:剪取大鼠部分左心室組織,脫水、石蠟包埋、切片脫蠟后,進行Weigert鐵蘇木素染色液染色,鹽酸酒精分化,自來水沖洗,經麗春紅酸性品紅、磷鉬酸、苯胺藍及冰醋酸染色處理,最后脫水并使用中性樹脂封片,置于通風櫥內晾干,光鏡下觀察心肌組織病理形態改變并采集圖片,利用Image J軟件計算心肌膠原體積分數(CVF)。CVF=單視野內膠原面積/心肌總面積×100%。

1.2.6 免疫組化法檢測心肌組織TGF-β1表達:心肌組織脫水,石蠟包埋,切片脫蠟,水浴鍋高溫抗原修復,滴加阻斷劑10 min,PBS沖洗,用羊血清工作液室溫血清封閉40 min,滴加兔抗TGF-β1抗體(1∶1000)濕盒4 ℃孵育過夜,次日,PBS沖洗,滴反應增強液20 min,PBS沖洗,加入酶標二抗在室溫下孵育20 min,PBS沖洗,現配DAB可視化顯色,鏡下控制反應時間1～2 min。最后進行常規脫水、透明、封片。切片置于玻片掃描儀中,每個切片隨機選取1個視野區域進行分析,應用Image J軟件計算平均光密度值(AOD)。

1.2.7 酶聯免疫吸附測定法檢測心肌組織TGF-β1表達:心肌組織置于4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液中勻漿處理后,使用ELISA試劑盒檢測TGF-β1濃度,所有操作均按照試劑盒提供的操作說明書進行。

1.2.8 蛋白印跡法檢測心肌組織TGF-β1表達:通過RIPA試劑盒提取組織總蛋白,BCA試劑盒定量各組蛋白,每組使用相等的蛋白上樣量在SDS-PAGE濃縮膠上樣孔中進行點樣并電泳分離,通過濕轉膜法將分離的蛋白轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜,通過TBST緩沖液清洗PVDF膜,二抗孵育2 h,ECL顯色液顯影。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prism 9統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差形式表示,兩組間數據比較采用非配對t檢驗,兩組以上數據比較采用單因素方差分析,多重比較采用Tukey或Bonferroni的多重比較檢驗;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 共計48只大鼠成功建立DCM模型。對照組大鼠未出現多飲、多食、小便增多、體重減輕等情況,精神狀態好,活動自如;模型組大鼠出現多飲、多食、小便增多、體重減輕等,精神狀態差;陽性藥物纈沙坦組及通心絡低、中、高劑量組在灌胃期間上述癥狀較模型組均有不同程度改善。

2.2 各組大鼠心肌組織HE染色 各組大鼠心肌組織HE染色見圖1。對照組大鼠心肌組織排列整齊,心肌結構清晰,細胞核清晰,心肌間隙清晰可見,橫紋明顯;模型組心肌排列紊亂、增粗,組織腫脹,炎性細胞浸潤明顯;通心絡低、中、高劑量組和纈沙坦組心肌組織排列較模型組整齊,炎性浸潤減少,組織間隙無明顯水腫。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變(HE染色,×200)

2.3 各組大鼠心肌組織Masson染色 對照組大鼠心肌組織細胞排列整齊,細胞間質有少量藍色膠原纖維,膠原纖維著色淡;模型組大鼠心肌組織細胞排列紊亂且膠原纖維藍染,藍色膠原在視野中組織占比大;通心絡低、中、高劑量組以及纈沙坦組膠原纖維藍染較模型組均明顯減少,陽性面積占比均減少,且通心絡高劑量組陽性面積明顯少于纈沙坦組。見表1(圖2)。

表1 各組大鼠心肌組織CVF比較(%)

圖2 各組大鼠心肌組織病理改變(Masson染色,×200)

2.4 免疫組化染色檢測各組大鼠心肌組織TGF-β1表達 對照組心肌細胞間質有少量的棕黃色膠原纖維,無明顯特異性染色;模型組大鼠心肌纖維化明顯,陽性面積表達范圍擴大,TGF-β1蛋白表達明顯增強,細胞核及間質內均有強表達;通心絡低、中、高劑量組及纈沙坦組較模型組染色范圍均縮小,纖維化程度低,陽性面積表達及TGF-β1蛋白表達均有較明顯的減弱。見表2(圖3)。

表2 各組大鼠心肌組織TGF-β1的AOD值比較(%)

圖3 各組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(免疫組化染色,×200)

2.5 酶聯免疫吸附測定法檢測各組大鼠心肌組織TGF-β1表達 見表3。與空白組比較,模型組TGF-β1蛋白表達升高(P<0.05);與模型組比較,通心絡低、中、高劑量組及纈沙坦組TGF-β1蛋白表達顯著降低,差異有統計學意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織TGF-β1表達比較(ng/ml)

2.6 蛋白印跡法檢測各組大鼠心肌組織TGF-β1表達 見表4(圖4)。相較于對照組,模型組TGF-β1蛋白表達顯著增高(P<0.05);與模型組相比,通心絡低、中、高劑量組TGF-β1蛋白表達明顯降低,差異有統計學意義(均P<0.05);表明不同濃度的通心絡膠囊對心肌組織TGF-β1表達有明顯的調控作用。

表4 各組大鼠心肌組織TGF-β1表達比較

A:對照組;B:模型組;C:纈沙坦組;D:通心絡低劑量組;E:通心絡中劑量組;F:通心絡高劑量組

3 討 論

目前,全球的糖尿病患病人數逐年增加,DCM的發病率也逐年上升[11]。目前研究發現,DCM的發病與心肌細胞的結構和功能改變相關[12]。糖尿病代謝紊亂直接影響心肌細胞及心臟成纖維細胞,改變心肌細胞功能和膠原在心臟間質中沉積,由此心肌順應性和舒縮功能下降,心肌結構發生實質性改變[13]。在高糖狀態下,多種代謝途徑被激活且相互作用,冠狀動脈微循環灌注不足,心肌細胞肥大、凋亡,心肌纖維化,心臟舒縮功能受損障礙,最終導致心力衰竭,危及患者生命[14]。DCM生理病理機制包括全身代謝紊亂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活不當、亞細胞成分異常、氧化應激、炎癥反應和免疫調節功能失調,復雜的生理病理改變最終導致DCM的心臟結構改變,共同作用于心臟重塑[15]。DCM心臟結構重塑包括間質和血管周圍纖維化和結締組織膠原沉積,還包括心肌細胞壞死、肌肉原纖維逐漸消失、反應性心室肥厚、小冠狀動脈增厚硬化等。長期高血糖刺激與心肌纖維化發展緊密相關[16]。當前DCM研究主要集中于抑制心肌成纖維細胞過度增殖、細胞外基質(ECM)過度沉積,調節膠原降解與合成失衡[17]。TGF-β1被認為是介導各器官組織纖維化的關鍵因子[18-19]。TGF-β1在心臟中主要存在于心肌細胞及心肌纖維細胞中,是調節心肌肥厚最重要細胞因子之一,同時也是膠原纖維產生及其他細胞外成分合成、沉積的始動因子。TGF-β1在心血管系統具有多種病理生理作用,可調節細胞增殖、分化,啟動心肌成纖維細胞的轉化和增生,抑制細胞外基質降解酶的活性,促使膠原蛋白異常表達性增高,導致細胞外基質降解與合成失衡,最終引發心肌纖維改變[20]。心臟組織TGF-β1表達水平顯著上升與心室重塑有密切聯系,提示其可作為早期診斷糖尿病心肌病變的依據之一[21]。TGF-β1可通過激活基于Smads和非Smads信號通路誘導纖維化,導致肌成纖維細胞激活及ECM的過量合成和抑制[22]。研究表明,在糖尿病心肌組織中TGF-β1及其受體蛋白表達量顯著增加,TGF-β1激活后引起心肌纖維化,并激活下游Samd蛋白誘導DCM[23]。高糖環境下,TGF-β1被大量活化,ECM降解與合成失衡,致使心肌纖維化,因此阻斷TGF-β1信號通路可延緩心肌纖維化進程[24]。

目前臨床上治療DCM多為藥物治療,如ACEI類和ARB類藥物等,在一定程度可減輕臨床癥狀,但長期用藥易出現胃腸道刺激、高血鉀、低血壓、肝功能損傷等,且長期治療極易藥物耐受,一旦停止用藥,可能會再次發病甚至加重病情[25]。在中醫傳統理論指導下,中醫藥可以多成分、多途徑、多靶點的在防治DCM方面發揮獨特優勢[26]。DCM歸屬于中醫“消渴心病”等范疇,其病位主要在心[27]。如《傷寒論》云:“消渴,氣上撞心,心中痛熱”,認為其在“消渴”的基礎繼發出現“心病”之癥。DCM的病程進展與消渴病的進展緊密聯系。中醫認為,糖尿病心肌病多由過食肥甘厚膩、稟賦不足及情志所傷而致,痰濁、瘀血是疾病發展的產物,陰虛為本貫穿始終,“虛”和“瘀”為主要病機特點,早期氣陰兩虛、心脈不和,治療以補氣陰為主;中期發展為痰瘀互結,注重祛痰化瘀;消渴日久,遷延不愈,終致氣血陰陽俱虛,以滋陰溫陽為主。在疾病發展過程中氣陰兩虛、絡脈空虛是本病發生的始動因素,而絡脈瘀阻是本病形成的病理基礎。通心絡膠囊由人參、蟲、水蛭、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、全蝎、冰片組成。研究顯示,通心絡膠囊干預DCM可抑制心肌纖維化,改善心肌病理損傷[28]。通心絡中主要成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、芍藥苷等具有抗纖維化作用[29]。人參皂苷Rb1和芍藥苷可以通過TGF-β1/Smad等信號通路抑制多器官組織間質細胞纖維化[30],這可能是通心絡抑制心肌纖維化的有效物質基礎。

本研究通過2%STZ一次性腹腔注射構造DCM大鼠模型,Masson染色顯示DCM模型組大鼠膠原沉積較對照組明顯增多,DCM模型組大鼠心臟組織中TGF-β1表達顯著增高,且心臟出現纖維化病理改變,心肌纖維斷裂,排列結構紊亂,心肌細胞間質膠原纖維沉積,給予通心絡膠囊治療后可不同程度緩解心肌纖維化損傷,心臟組織中TGF-β1表達降低。綜上所述,通心絡膠囊可能通過抑制TGF-β1蛋白的表達改善DCM大鼠心肌纖維化和心肌結構紊亂。