銀腺楊生長素受體基因PagFBL3 對莖生長發育的影響*

左雯騰 孟佳慧 盧孟柱 王留強,2

（1.林木遺傳育種全國重點實驗室 國家林業和草原局林木培育重點實驗室 中國林業科學研究院林業研究所 北京 100091；2.南方現代林業協同創新中心 南京林業大學 南京 210037；3.省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室浙江農林大學林業與生物技術學院 杭州 311300）

在植物次生生長中，植物激素起著重要的調節控制作用。其中，生長素是一類具有極性運輸特性的天然植物內源激素，普遍存在與低、高等植物中，處于植物生長發育的調控中心（Leyser, 2018）。它主要在莖尖、根尖及其它幼嫩組織合成后，以形態學上端向下端的極性運輸方式成為長距離運輸的信息攜帶者，通過一系列的信號轉導途徑調節植物生長發育的諸多生理過程，如維管組織形成、根伸長、不定根的形成、頂端優勢、向性反應、胚胎發生以及維持葉片和花的形態建成等（Bowmanet al., 2008）。研究表明，頂端分生組織產生的生長素不僅參與維管組織的分化和生長，還能促進形成層細胞的增殖（Smetanaet al., 2019;Zhenget al., 2021）。Nilsson 等（2008）發現在轉基因雜交山楊（Populus tremula×P.tremuloides）中，生長素濃度的降低導致木質部細胞分裂減少，同時還發現，生長素響應基因PttHB8以及生長素/吲哚乙酸（Aux/IAA）家族基因的表達模式與生長素濃度有著密切的關系。Baba 等（2011）還發現雜交山楊在休眠期間由于形成層對生長素響應能力降低，致使形成層細胞停止分裂。Hu 等（2022）揭示了生長素和赤霉素通過破壞DELLAARF7-AUX/IAA 三元復合體，釋放ARF7 對下游基因WOX4、PIN1的轉錄調控，進而協同調控形成層活動。因此，認為一定濃度的生長素是形成層活動和次生維管組織發育所必須的，且發揮重要的調控作用。

生長素在植物生長發育中通過信號轉導途徑來發揮重要的調控作用，而生長素信號轉導至少需要3個蛋白家族的成員進行調控：生長素運輸抑制劑F-box家族的TIR1/AFB 蛋白，生長素轉錄抑制因子Aux/IAA以及生長素應答因子ARF（auxin response factor）（Yuet al., 2013）。其中，生長素受體是該信號轉導途徑的關鍵因子，TIR1（transport inhibitor response 1）在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中首次被鑒定出來，是一個含有F-box 的蛋白質（Rueggeret al., 1998）。在植物體內，當生長素濃度較低時，TIR1 不能與轉錄抑制因子Aux/IAA緊密結合，而Aux/IAA 與ARF 結合，抑制了ARF 的轉錄活性；當生長素濃度較高時，細胞核中的IAA 與SCFTIR1復合體（泛素連接酶3）中的TIR1 結合，可以促進SCFTIR1復合體與Aux/IAA 蛋白識別，形成SCFTIR1-Aux/IAA 復合體，啟動Aux/IAA 蛋白的泛素化過程，最終被26S 蛋白酶體降解，使ARF 啟動或抑制生長素下游響應基因的轉錄，進而調控植物的生長發育（Salehinet al., 2015）。另 外，AFB1、AFB2、AFB3 與TIR1 具有類似的作用，都能夠作為生長素受體和生長素結合后，再與SCF 結合形成復合物，從而導致Aux/IAA 與之結合，參與生長素調節的反應（Dharmasiriet al., 2005）。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀腺楊雜種無性系84K 楊用于基因克隆、基因表達分析和遺傳轉化。所有植物材料均由中國林業科學研究院林木遺傳育種全國重點實驗室保存并繁殖。楊樹組培苗于生根培養基（1/2 MS 基礎培養基，0.05 mg·L-1IBA，0.02 mg·L-1NAA，5 g·L-1瓊 脂 粉 和30 g·L-1蔗糖，pH 5.8～6.0）中培養，置于人工氣候室（25 ℃，16 h/8 h 光照/黑暗，50 μmol·m-2s-1光照強度）。生長20 天后，將其移栽至裝有營養土（土壤∶珍珠巖 =3∶1,V/V）的花盆（口徑×底徑×盆高=12 cm × 8 cm ×15 cm）中，置于同等條件下的培養室中繼續培養。選取了培養60 天、生長狀態良好、且長勢一致的非轉基因84K 楊植株進行PagFBL3基因組織表達特異性分析，所需的根、幼葉（頂端第3 片葉）、成熟葉（頂端第7 片葉）、1/2 株高處莖部、木質部、維管形成層和韌皮部分別取自5 個獨立非轉基因84K 楊植株。選取了培養30 天、生長狀態良好、且長勢一致的轉基因株系和非轉基因84K 楊植株，定量分析PagFBL3基因在不同基因型植株中的表達情況，所用的幼苗頂端第5片葉取自各5 個獨立植株。以上試驗均重復取樣3 次，樣品液氮速凍置于-80 ℃保存用于RNA 提取。

本氏煙草（Nicotiana benthamiana）用于瞬時轉化。種子表面消毒后播撒于1/2 MS 固體培養基中，1 周后移栽至營養土（土壤與珍珠巖體積比為 3∶1）中，置于培養室（25 ℃，16 h/8 h 光照/黑暗）中繼續培養20 天后，取健康且平展的成熟葉片用于瞬時轉化農桿菌（Agrobacterium tumefaciens），研究基因亞細胞定位。

1.2 載體和試驗試劑

本研究所使用的中間載體pDNOR207、植物過表達載體pMDC32、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 及農桿菌GV3101 菌種均由本實驗室保存。PCR 引物合成和序列測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。高保真擴增酶Primer STAR HS、普通擴增酶PCR-Mix、定量試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM Kit）、反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit）、DNA marker 均為Takara 公司產品。膠回收試劑盒、PCR 產物純化試劑盒和質粒小量提取試劑盒均為Omega 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 生物信息學分析 利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析PagFBL3 蛋白的理化性質。利用Phytozome 網 站（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）獲得擬南芥和毛果楊（Populus trichocarpa）生長素受體家族FBL 的氨基酸序列；同時，利用NCBI 網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找獲取不同物種中FBL3 蛋白的氨基酸序列。利用DNAMAN和MEGA11 軟件分析FBL 蛋白氨基酸序列相似性和系統進化關系。系統進化樹采用鄰接法（neighborjoining method）構建，節點旁的數字表示基于1 000 次重復次數的自展值（bootstrap）。

1.3.2 RNA 提取、cDNA 合成以及RT-qPCR 分析采用CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）法提取上述不同楊樹組織樣品的總RNA。利用RQ1 RNasefree DNase（Promega，Madison，WI，USA）處理總RNA去除DNA 污染。利用反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit）合 成cDNA。使 用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa，Dalian，China），在實時熒光定量PCR 儀器Light Cycler 480（Roche Applied Science，Penzberg，Upper Bavaria，Germany）上進行RT-qPCR 分析，以2 個84K 楊PagActin基因作為內參，每個試驗均設有3 次生物學重復和4 次技術重復，相對表達量根據2-ΔΔCT方法進行計算。用于RT-qPCR 的基因特異性引物使用Primer 5 軟件設計，其序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.3 基因克隆、載體構建和84K 楊遺傳轉化 以84K 楊cDNA 為模板，利用特異性引物，擴增PagFBL3基因編碼區序列，通過Gateway BP 反應重組進入中間載體pDNOR222 后，再通過Gateway LR 反應亞克隆至終載體pMDC32，電擊轉化農桿菌GV3101，以農桿菌介導的葉盤法轉化84K 楊（Liuet al., 2014）。簡言之，在含有200 mg·L-1特美汀和3 mg·L-1潮霉素的芽分化培養基上篩選抗性芽，隨后在含有同樣濃度抗生素的生根培養基上誘導生根。摘取幼苗葉片，提取基因組總DNA 和總RNA，利用PCR 技術對其進行分子鑒定。

1.3.4 亞細胞定位分析 通過Gateway LR 反應，將PagFBL3基因編碼區序列（不含終止子）亞克隆至pEarleyGate 101 載體上，構建35S::PagFBL3-GFP 融合表達載體，電擊轉化農桿菌GV3101。利用農桿菌介導的遺傳轉化瞬時侵染煙草葉片，黑暗培養48 h 后，在蔡司LSM510 共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）下觀察煙草表皮細胞內的GFP 熒光信號。

1.3.5 轉基因楊樹的表型鑒定和組織切片分析 選取20 天左右、生長狀態良好且長勢一致的轉基因和非轉基因84K 楊組培苗移栽至裝有營養土的塑料盆中，置于溫室中繼續培養60 天后，對各個植株的株高、地徑和節間數進行測定。每次試驗至少3 次生物學重復，每次至少測量9 株材料。

尹軍平還表示，隨著“三通一達”、順豐、德邦等的陸續上市，整合大幕實際上已然拉開，而且行業內并購標的也在快速增加，一方面第一代物流企業家已到退休年齡，而很多二代不太愿意接班；另一方面，80、90年代出生的企業家家族觀念沒那么強，很多企業家創業成功后并不介意通過并購退出。

同時，截取培養60 天的楊樹自頂端向下第6、12、15 節間中部（約0.5～1 cm）的莖部材料，將其放置固定于樣品架上，通過震蕩切片機（LEICA VT1000）進行橫切（切片厚度為50 μm）。將切片置于0.05%甲苯胺藍O（Toluidine blue O，TBO）溶液中染色后，用Olympus BX51 顯微鏡進行觀察并及時拍照，并利用Image J 軟件測量照片中木質部的寬度，每次試驗至少3 次生物學重復，每次至少測量3 個不同區域。

1.4 數據統計

應用Microsoft Excel 和SPSS Statistics 24 軟件對數據進行處理，并使用t檢驗法分析差異顯著水平。

2 結果與分析

2.1 PagFBL3 基因克隆和序列分析

以84K 楊cDNA 為模板，使用特異引物通過PCR擴增獲得PagFBL3基因編碼區序列。系統進化關系分析結果表明，PagFBL3基因與擬南芥、毛果楊的FBL3 同屬于一個系統發育分支，系統關系較近（圖1A）。多序列比對結果顯示，PagFBL3基因與擬南芥、毛果楊、柳樹（Salix babylonica）等物種的FBL3基因序列相似度較高（圖1B），其中與擬南芥和毛果楊核酸序列相似度分別為71.4%和98.48%，蛋白序列相似度為72.96%和97.72%，一些區域存在著明顯的保守序列，可能是重要的功能結構域。PagFBL3基因編碼區全長1 716 bp，可編碼571 個氨基酸殘基的蛋白質，蛋白分子量約為64.14 kDa，理論等電點（pI）為6.51。

2.2 PagFBL3 的組織表達和亞細胞定位分析

為了研究PagFBL3基因的組織表達特異性，采用RT-qPCR 技術分析了PagFBL3基因在84K 楊根、幼葉（頂端第3 片葉）、成熟葉（頂端第7 片葉）、1/2 株高處莖部、木質部、維管形成層和韌皮部中的表達。結果顯示，PagFBL3基因在各組織中均有表達，并在成熟葉、次生莖及其次生木質部中具有較高表達，在維管形成層和韌皮部中也有一定的表達量，相對較低（圖2A）。

圖2 PagFBL3 基因在84K 楊不同組織中的表達（A）及PagFBL3 的亞細胞定位分析（B）Fig.2 Expression of PagFBL3 in different tissues of 84K poplar(A) and subcellular localization (B) of PagFBL3

構建35S::PagFBL3-GFP 融合表達載體，通過瞬時轉化本氏煙草葉片，并檢測葉片中的GFP 信號。結果發現，GFP 熒光信號分布于細胞核，表明PagFBL3 是一個核定位蛋白質（圖2B）。

2.3 過表達PagFBL3 轉基因楊樹的獲得及其表型鑒定

為了進一步研究PagFBL3基因在楊樹生長發育中的作用，構建了植物過表達載體35S::PagFBL3，通過農桿菌介導的葉盤法創制轉基因楊樹，并通過再生芽、抗生素篩選和基因組DNA 分子檢測鑒定陽性轉基因植株，共鑒定了11 個獨立轉基因株系（OE1-OE11）（圖3A-D），進一步采用實時定量PCR 檢測PagFBL3基因在各轉基因和非轉基因84K 楊中的相對表達水平，與非轉基因84K 植株相比，PagFBL3在各轉基因株系中的相對表達量水平均有不同程度的提高，表明PagFBL3已成功轉入84K 楊中，并能夠過量表達（圖3E）。從中選取2 個表達量較高的獨立轉基因株系（OE5 和OE7）用于后續的表型比較和功能分析。

圖3 過量表達PagFBL3 轉基因楊樹表型分析Fig.3 Phenotypes of transgenic plants overexpressing PagFBL3 gene

將20 天的生長狀態良好且長勢一致的過表達（OE5 和OE7）轉基因和非轉基因84K 楊（對照）組培苗移栽至裝有人工土的塑料盆中，置于溫室培養60天后，觀察其表型變化，并測定其株高、地徑和節間數。與非轉基因84K 楊相比，兩個過表達轉基因的葉片形態結構沒有差別，長度和寬度以及長寬比也沒有顯著差異（圖3F）。株高和節間的統計結果顯示，過表達PagFBL3轉基因植株的株高均顯著高于非轉基因84K 楊6.3%和6.9%，且差異隨著植株生長更加明顯，而二者的節間數則無明顯差異（圖3G，I）；地徑的統計結果顯示，過表達PagFBL3轉基因植株的地徑均大于非轉基因84K 楊，且存在顯著差異，分別增加了6.7%和8.5%（圖3H）。以上結果表明，PagFBL3基因參與了84K 楊莖部的次生生長和發育。

2.4 過表達PagFBL3 對楊樹生長和木質部發育的影響

為進一步揭示PagFBL3基因在楊樹莖部生長發育中的作用，對生長60 天過表達PagFBL3轉基因和非轉基因84K 楊莖段的第6、12 和15 節間進行解剖分析，并統計木質部寬度。結果顯示，木質部細胞的形態學特征也沒有明顯差異，但過表達轉基因植株的第12 和15 節間木質部寬度明顯大于非轉基因84K楊（圖4A）。其中，過表達PagFBL3轉基因第12 節間的木質部寬度比非轉基因84K 楊高出11.6%和15.7%，第15 節間差異更顯著，高達17.3%和19.9%（圖4B）。以上結果表明過表達PagFBL3基因影響了植株次生生長，主要表現在株高、地徑和莖部木質部發育方面。

圖4 過表達PagFBL3 對轉基因楊樹木質部發育的影響Fig.4 Effects of PagFBL3 gene on xylem development of transgenic poplar

3 討論

生長素與生長素受體結合是研究生長素信號傳導途徑的一個關鍵環節，生長素信號的傳導離不開生長素受體參與，作為生長素信號通路最上游的調控因子，控制著生長素信號傳導開關（Peer, 2013）。生長素受體基因（TIR1/AFBs）介導的生長素信號通路在植株生長發育過程中起著重要作用，如調控植物器官發生、子葉和根系發育，響應生物逆境脅迫和非生物逆境脅迫，維持植株的正常發育等（Chenet al., 2015）。在本研究中，生長素受體基因PagFBL3能夠促進轉基因楊樹木質部發育，顯著增加了木質部寬度，提高了轉基因楊樹的徑向生長，同時增強了轉基因楊樹的高生長。因此，開展生長素受體相關研究對于揭示生長素在樹木次生生長中的作用機制具有重要意義。

目前，對于植物生長素受體基因的研究多集中在不定根發育方面。擬南芥TIR1基因明顯增加了側根的數量（Lakehalet al., 2019），AtAFB3可特異地響應硝酸鹽信號調控主根長度及側根發生密度（Vidalet al.,2010），afb4缺失型突變體側根的數量明顯少于野生型幼苗（Huet al., 2012）。水稻TIR1和AFB2受miR393調控下調表達，導致主根和根冠增長，而過表達OsTIR1基因顯著促進轉基因水稻不定根和側根的發生，增加不定根數目和側根密度（Guoet al., 2021）。然而，對于植物地上部分的生長發育，尤其是次生生長研究較少。擬南芥生長素受體TIR1/AFB 通過參與生長素信號通路影響植株的葉片發生數目及子葉生長的偏上性狀（Si-Ammouret al., 2011）。水稻OsTIR1基因促進分蘗，顯著增加轉基因植株地上部生物量（Guoet al., 2021）。在木本植物楊樹中，生長素受體FBL基因家族成員FBL1的較高表達促使轉基因楊樹比非轉基因植株具有了更寬的韌皮部、木質部和更多的形成層細胞層；此外，過表達PagFBL1基因不僅能夠增加轉基因84K 楊的根系生物量（Shuet al., 2019），還能夠影響轉基因植株的株高、地徑和地上部分生物量等（舒文波等, 2015），以上結果表明，FBL1 介導的生長素信號轉導系統對木本植物生長發育具有重要的影響。

本研究克隆了銀腺楊生長素受體家族基因PagFBL3，序列分析和系統發育進化樹分析表明，該基因與毛果楊、擬南芥的FBL3基因序列相似度較高。實時熒光定量PCR 研究發現，PagFBL3基因主要在成熟葉和次生莖中表達量較高，且編碼蛋白定位于細胞核，這與前人的研究結果一致（Shuet al., 2015），該結果表明PagFBL3基因可能參與莖的次生生長發育中發揮重要作用。為了進一步探究PagFBL3對莖生長發育的影響，本研究創制了過表達PagFBL3基因的轉基因楊樹，并比較了生長60 天的轉基因植株盆栽苗的生長和木質部發育情況。與非轉基因84K 楊相比，過表達PagFBL3轉基因楊樹株高明顯高于非轉基因楊樹，說明了PagFBL3對楊樹高生長起著正調控作用（圖3）。同時，過表達PagFBL3促進轉基因楊樹木質部發育，顯著增加了木質部寬度，提高了轉基因楊樹的徑向生長（圖4）。

以上結果表明PagFBL3 與PagFBL1 雖然是楊樹生長素受體不同的成員，但都可能作為生長素信號通路最上游的調控因子，通過過量表達增強生長素信號轉導途徑，引起了下游相關基因表達（如Aux/IAA、ARF 等），促進了楊樹莖段的次生生長。生長素能夠誘導楊樹Aux/IAA9-ARF5 模塊，直接激活兩個HDZIP III 轉錄因子基因的表達，啟動維管形成層細胞向次生木質部的分化，從而促進木材形成（Xuet al.,2019），但生長素受體PagFBL3 是否與Aux/IAA9 或其它Aux/IAA 相互作用，又影響哪些下游相關基因的表達，進而調控樹木次生生長尚不清楚；另外，本文僅對生長60 天以內的轉基因植株盆栽苗進行了生長和木質部發育檢測，對全生長季及多年生植株的表現尚不明確，且分子作用機制尚未探索，包括PagFBL3基因受哪些上游轉錄因子調控，其具體上游分子調控機制有待解析，這些研究結果將對全面了解生長素受體在次生生長中的作用機制提供幫助，也為我國林木木材品質遺傳改良提供相應的理論基礎。

4 結論

本研究從銀腺楊‘84K’中克隆了一個生長素受體基因PagFBL3，該基因編碼區全長1 716 bp，編碼571個氨基酸殘基的核定位蛋白質。PagFBL3基因在根、莖和葉中均有表達，并在成熟葉和次生莖中表達量較高。與非轉基因楊樹相比，過表達PagFBL3轉基因楊樹株高明顯高于非轉基因楊樹，說明了PagFBL3對楊樹高生長起著正調控作用。同時，過表達PagFBL3促進轉基因楊樹木質部發育，顯著增加了木質部寬度，提高了轉基因楊樹的徑向生長。以上研究結果表明，PagFBL3基因介導的生長素信號轉導途徑對木本植物生長發育具有重要的影響，但其調控機制有待進行深入解析。