五加皮中二萜類化學成分及其抗炎活性研究

張 雪 ，解盈盈，劉 琦，關永霞，趙淑秀，劉青芝，林永強，郭東曉 ?

1.山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥監局膠類產品質量評價重點實驗室，山東省中藥標準創新與質量評價工程實驗室，中藥配方顆粒共性技術山東省工程研究中心，山東 濟南 250101

2.山東現代學院，山東 濟南 250104

3.經方與現代中藥融合創新全國重點實驗室，山東 臨沂 276006

4.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355

五加皮為五加科五加屬植物細柱五加AcanthopanaxgracilistylusW.W.Smith.的干燥根皮，又稱南五加皮、五谷皮、紅五加皮，主要分布于我國湖北、河南、陜西、安徽、浙江、遼寧、河北等省，為臨床常用的傳統中藥材[1]。五加皮始載于《本經》，主要功效為祛風除濕、補益肝腎、強筋壯骨、利水消腫，臨床上主要用于治療風濕痹病、筋骨萎軟、小兒行遲、體虛泛力、水腫和腳氣等疾病[2]。《中華本草》[3]中記載五加皮具有抗炎鎮痛、抗應激、抗腫瘤、提高免疫力等作用，其化學成分主要有揮發油類、萜類、甾醇類、有機酸類、脂肪酸類、苯丙素類、黃酮類等[4]。現代藥理學研究表明，五加皮具有很好的抗炎活性[5-6]。

本研究從五加皮70%乙醇提取物中分離得到13 個二萜類化合物，包括7 個海松烷型二萜7β-羥基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸 [7β-hydroxy-entpimara-8(14),15-dien-19-oic acid，1]、7- 酮基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸 [7-oxo-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid，2]、7β-甲氧基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸 [7β-methoxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid，3]、6,8(14),15-三烯-19-異海松羧酸[ent-pimara-6,8(14),15-trien-19-oic acid，4]、14-酮基-8,15-二烯-19-異海松羧酸（14-oxo-ent-pimara-8,15-dien-19-oic acid，7）、14-羥基-16-乙烯基-8,11,13-三烯-17-異海松羧酸（14-hydroxy-16-devinyl-entpimara-8,11,13-trien-17-oic acid，8）、7α-羥基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸[7α-hydroxy-entpimara-8(14),15-dien-19-oic acid，11]；以及6 個貝殼杉烷型二萜16α,17-二羥基-19-異貝殼杉烷羧酸（16α,17-dihydroxy-ent-kaur-19-oic acid，5）、17-羥基-19-異貝殼杉烷羧酸（17-hydroxy-ent-kaur-19-oic acid，6）、異貝殼杉烯酸（ent-kaur-16-en-19-oic acid，9）、17-醛基-19-異貝殼杉烯酸（17-oxo-ent-kaur-19-oic acid，10）、17-醛基-15-烯-19-異貝殼杉烷酸（17-oxo-ent-kaur-15-en-19-oic acid，12）和17-羥基-15-烯-19-異貝殼杉烷酸（17-hydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid，13）。其中化合物8 為新化合物，命名為細柱五加酸G1，3 和4 為首次從細柱五加植物中分離得到。采用Griess 法測試脂多糖誘導小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 細胞釋放炎癥因子模型，對分離得到的化合物進行了抗炎活性評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance Ⅲ 600 核磁共振波譜儀，德國布魯克公司；METTLER TOLEDO XSE205 型電子天平，瑞士梅特勒托利多公司；Buchi R210 型旋轉蒸發儀，瑞士步奇公司；Agilent 1200 型HPLC 色譜儀，美國安捷倫公司；HPLC-IT-TOF-MS 液質聯用儀，日本島津公司；Bio Tek EPOCH2NS 酶標儀，美國博騰公司。

乙醚、正丁醇、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、二氯甲烷等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；MCI GEL CHP20P（37～75 μm），日本三菱化學株式會社；柱色譜硅膠（200～300 目），青島海灣精細化工有限公司；Sephadex LH-20，北京索萊寶科技有限公司；硅膠薄層板，煙臺市化學工業研究所；HPLC 色譜柱，SymmentryShiedTMRP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；MTT 溶液，北京鼎國昌盛生物技術有限公司；（Eagle）DMEM 高糖培養基，美國Gibco 公司；胎牛血清，上海達特希爾生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），Life Science 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；對氨基苯磺酰胺，北京鼎國昌盛生物技術有限公司；胰酶，北京鼎國昌盛生物技術有限公司；3,4-二羥基苯甲羥肟酸（DiDOX），美國MedChem Express 公司，批號HY-19387/CS-5292；小鼠巨噬細胞RAW264.7，美國菌種保藏中心（ATCC）；NO 試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 材料

五加皮產地為湖北，經山東省食品藥品檢驗研究院穆向榮副主任藥師鑒定為五加科五加屬植物細柱五加A.gracilistylusW.W.Smith.的干燥根皮，樣品（SDIFDC-G-AGZ01）保存于山東省食品藥品檢驗研究院。

2 方法

2.1 提取與分離

取五加皮藥材4 kg，粉碎，以70%乙醇為溶劑，加熱回流提取3 次，每次1 h，合并提取液，減壓回收溶劑，得到粗提物浸膏600 g。將粗提物用適量溫水分散，用乙醚萃取3 次，合并萃取液，減壓濃縮得乙醚層浸膏130.2 g。將乙醚層浸膏溶解后經MCI樹脂柱分離，用甲醇-水溶液（40%～100%）梯度洗脫，共得到7 個流分。流分4 用硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮系統（100∶1～1∶1）進行梯度洗脫，經TLC 檢測并合并相同組分，得到Fr.4A～4U 共21個組分。組分4L 經結晶得到化合物1（60 mg），經硅膠柱（石油醚-丙酮19∶5～17∶1）分離，結晶得到化合物4（2.0 mg）；組分4J 和4D 經結晶分別得到2（32 mg）和3（33 mg）；組分4N 先后經石油醚-醋酸乙酯（15∶1～10∶1）洗脫和HPLC 色譜（柱溫40 ℃，甲醇-水56∶44，tR＝11.320 min）分離得到化合物6（4.7 mg）；組分4H 經硅膠柱（二氯甲烷-甲醇100∶1～80∶1）和HPLC 色譜（甲醇-水68∶32）分離得到化合物7（28 mg）；組分4R 經硅膠柱（二氯甲烷-甲醇90∶1～70∶1）分離得到化合物5（21 mg）。流分3 用硅膠柱，以石油醚-丙酮系統（100∶1～1∶1）進行梯度洗脫，得到Fr.3A～3X 共24 個組分。組分3J 經凝膠柱和HPLC 色譜（柱溫35 ℃，甲醇-水70∶30）分離得到化合物8（3.3 mg）。流分5 用硅膠柱，以石油醚-丙酮系統（100∶1～1∶1）進行梯度洗脫，得到Fr.5A～5M 共26 個組分。組分5B 經結晶得到化合物9（205 mg）；組分5J 經凝膠柱和重結晶得到化合物11（1.0 mg）；組分5E 先后經凝膠和硅膠柱（石油醚-醋酸乙酯50∶1～43∶1）分離得到化合物10（34 mg）和12（3.6 mg）。流分6 用硅膠柱，以石油醚-丙酮系統（100∶1～1∶1）進行梯度洗脫，得到Fr.6A～6J 共10 個組分。組分6G 經凝膠柱色譜分離得到化合物13（9.7 mg）。

2.2 抗炎活性研究

2.2.1 RAW264.7 細胞培養 在37 ℃、5% CO2環境下，向高糖DMEM 培養基中加入10%的胎牛血清，加入復蘇的RAW264.7 細胞。取對數生長期的細胞，用胰酶消化，制成細胞懸液，計數并稀釋細胞密度為8×104個/孔。以每孔200 μL 的量加入96孔板，待細胞在培養箱中培養36 h 后用于實驗。

2.2.2 MTT 法檢測藥物對RAW264.7 細胞活力的影響 將對數生長期細胞調整細胞濃度為8×105個/孔，接種于96 孔板中，每孔200 μL，分為空白對照組、陽性對照組（陽性藥物為DiDOX）和實驗組（加入待測化合物）處理。細胞分別培養24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續培養2 h，棄去上清液，加入200 μL DMSO 避光振搖10 min，采用全波長酶標儀在570 nm 波長處檢測各孔的吸光度（A）值，并按照公式計算細胞存活率。

細胞存活率＝A實驗/A空白對照

2.2.3 單體化合物對RAW264.7 細胞釋放NO 的測試 取對數生長期的RAW264.7 細胞，調整細胞濃度為2×105個/孔加入96 孔板中，每孔200 μL，在37 ℃、5% CO2環境下培養24 h，去除上清液，將細胞分為空白對照組（空白培養基）、LPS 組（1.0μg/mL LPS）、不同濃度的化合物（1.0 μg/mL LPS＋100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L）。各組細胞加入藥物或空白培養基后，繼續培養24 h。取上清液100 μL，加入100 μL Griess 試劑，室溫放置10 min，波長設置為570 nm，在酶標儀上測定A，將其代入標準曲線中，標準曲線為A＝0.006 4C＋0.002 4，r＝0.999 7，其中A為吸光度，C為亞硝酸鈉濃度，計算NO 釋放量。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 1 [M－H]?，理論值為317.212 2，推測分子式為C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.69(1H, dd,J= 17.3, 10.4 Hz, H-15), 5.46 (1H, brs, H-14),4.96 (1H, dd,J= 10.4, 1.7 Hz, H-16), 4.84 (1H, dd,J=17.4, 1.7 Hz, H-16), 4.28 (1H, brs, H-7), 2.20 (1H, dt,J= 14.0 Hz, H-3β), 2.12 (1H, m, H-9), 2.10 (2H, m, H-6), 1.84 (1H, dd,J= 9.0, 7.0 Hz, H-5), 1.79 (1H, dt,J= 3.4, 13.9 Hz, H-2β), 1.72 (1H, brd,J= 13.1 Hz, H-1β), 1.59 (2H, m, H-11β, 12β), 1.47 (1H, dq,J= 3.0,14.0 Hz, H-2α), 1.27 (3H, s, H-18), 1.24～1.37 (2H, m,H-11α, 12α), 1.12 (1H, m, H-3α), 1.11 (1H, ddd,J=13.5, 13.5, 4.5 Hz, H-1α), 1.04 (3H, s, H-17), 0.63 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.4 (C-19),146.4 (C-14), 140.2 (C-8), 133.2 (C-15), 113.3 (C-16),73.2 (C-7), 48.3 (C-5), 45.7 (C-9), 39.2 (C-4), 39.2 (C-1), 43.6 (C-10), 38.5 (C-13), 37.9 (C-3), 35.5 (C-12), 30.6(C-6), 29.0 (C-18), 28.8 (C-17), 19.6 (C-2), 18.7 (C-11),13.0 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[7]，故鑒定該化合物為7β-羥基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸。

化合物2：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:315.195 2 [M－H]?，理論值為315.196 6，推測分子式為C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 6.58(1H, s, H-14), 5.68 (1H, dd,J= 17.5, 10.5 Hz, H-15),5.00 (1H, dd,J= 10.5, 1.4 Hz, H-16α), 4.76 (1H, dd,J= 17.5, 1.4 Hz, H-16β), 3.13 (1H, dd,J= 18.8, 13.6 Hz, H-6α), 2.81 (1H, dd,J= 18.8, 5.0 Hz, H-6β), 2.19(1H, m, H-9), 2.01 (1H, dd,J= 16.4, 5.0 Hz, H-5), 1.25(3H, s, H-20), 1.13 (3H, s, H-18), 0.76 (3H, s, H-17)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 200.6 (C-7), 182.1 (C-19), 145.7 (C-15), 142.8 (C-14), 136.8 (C-8), 114.3 (C-16), 51.7 (C-5), 50.4 (C-9), 44.0 (C-4), 39.3 (C-13),38.8 (C-12), 38.7 (C-1), 38.0 (C-3), 37.3 (C-10), 35.0(C-6), 28.4 (C-18), 28.3 (C-17), 19.6 (C-2), 19.1 (C-11),12.9 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[8]，故鑒定該化合物為7-oxo-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物3：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:331.226 8 [M－H]?，理論值為331.227 9，推測分子式為C21H31O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.70(1H, dd,J= 17.3, 10.4 Hz, H-15), 5.40 (1H, s, H-14),4.97 (1H, dd,J= 10.4, 1.7 Hz, H-16), 4.88 (1H, dd,J=17.3, 1.7 Hz, H-16), 3.60 (1H, t,J= 3.1 Hz, H-7), 3.16(3H, s, H-21), 2.15 (2H, m, H-3), 2.06 (1H, m, H-6),1.92 (1H, m, H-9), 1.76 (1H, m, H-5), 1.68 (2H, m, H-1), 1.60 (2H, m, H-12), 1.46 (2H, m, H-2), 1.34 (2H, m,H-11), 1.26 (3H, s, H-18), 1.08 (3H, s, H-17), 0.65 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.6 (C-19),146.4 (C-15), 135.5 (C-8), 134.5 (C-14), 113.2 (C-16),81.7 (C-7), 54.6 (C-21), 48.8 (C-5), 45.7 (C-9), 43.6 (C-4), 39.1 (C-10), 38.8 (C-1), 38.7 (C-13), 37.8 (C-3),35.5 (C-12), 29.9 (C-6), 29.6 (C-17), 28.8 (C-18), 19.5(C-2), 18.7 (C-11), 13.2 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[9]，故鑒定該化合物為7β-methoxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物4：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:299.200 7 [M－H]?，理論值為299.201 7，推測分子式為C20H28O2。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 6.6(1H, dd,J= 2.7, 11.6 Hz, H-6), 6.03 (1H, brd,J= 11.6 Hz，H-7), 5.72 (1H, dd,J= 17.2, 10.1 Hz, H-15), 5.24(1H, s, H-14), 4.96 (1H, dd,J= 10.3, 1.7 Hz, H-16),4.86 (1H, dd,J= 17.3, 1.8 Hz, H-16), 2.15～2.25 (1H,m, H-3), 2.04～2.10 (1H, m, H-5), 1.91～1.99 (1H, m,H-9), 1.79～1.91 (1H, m, H-11), 1.68～1.75 (2H, m,H-1), 1.60～1.66 (1H, m, H-12), 1.53～1.55 (1H, m,H-11), 1.50～1.53 (1H, m, H-2), 1.33 (3H, s, H-18),1.28～1.31 (1H, m, H-12), 1.24～1.28 (1H, m, H-2),1.07～1.09 (1H, m, H-3), 1.07 (3H, s, H-17), 0.63 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 180.9 (C-19),147.3 (C-15), 135.9 (C-8), 131.7 (C-14), 128.3 (C-7),127.4 (C-6), 113.1 (C-16), 55.5 (C-5), 49.3 (C-9), 43.2(C-4), 38.9 (C-13), 37.9 (C-10), 37.4 (C-3), 37.2 (C-1),35.4 (C-12), 29.0 (C-17), 28.2 (C-18), 19.5 (C-11), 18.6(C-2), 11.8 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[10]，故鑒定該化合物為ent-pimara-6,8(14),15-trien-19-oic acid。

化合物5：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:335.221 9 [M－H]?，理論值為335.222 8，推測分子式為C20H32O4。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 3.70(1H, d,J= 11.3 Hz, H-17α), 3.59 (1H, d,J= 11.3 Hz,H-17β), 2.11 (1H, d,J= 13.4 Hz, H-3α), 2.02 (1H, brs,H-13), 1.18 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-20), 0.83 (1H,td,J= 13.0, 4.0 Hz, H-1β)；13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 181.5 (C-19), 82.8 (C-16), 66.8 (C-17), 58.0(C-5), 57.3 (C-9), 53.7 (C-15), 46.2 (C-13), 45.7 (C-8),44.6 (C-4), 43.2 (C-7), 41.8 (C-1), 40.7 (C-10), 39.1 (C-14), 38.1 (C-3), 29.3 (C-18), 27.1 (C-12), 23.2 (C-6),20.1 (C-2), 19.5 (C-11), 16.1 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[11]，故鑒定該化合物為16α,17-dihydroxyent-kaur-19-oic acid。

化合物6：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:319.226 8 [M－H]?，理論值為319.227 9，推測分子式為C20H32O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 3.29 (1H,s, H-17), 1.17 (3H, s, H-18), 0.96 (3H, s, H-20), 0.92～0.81 (1H, m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ:181.8 (C-19), 67.9 (C-17), 58.5 (C-5), 57.1 (C-9), 46.5 (C-15), 46.1 (C-8), 44.8 (C-4), 44.6 (C-16), 43.1 (C-14), 42.3(C-1), 41.0 (C-10), 39.7 (C-13), 39.4 (C-7), 38.2 (C-3),32.7 (C-12), 29.7 (C-18), 23.9 (C-6), 20.5 (C-2), 20.1 (C-11), 16.5 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[12]，故鑒定該化合物為17-hydroxy-ent-kaur-19-oic acid。

化合物7：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:315.195 5 [M－H]?，理論值為315.196 6，推測分子式為C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 6.04(1H, dd,J= 17.7, 10.9 Hz, H-15α), 5.07 (1H, d,J=10.8 Hz, H-16), 4.97 (1H, d,J= 17.6 Hz, H-16), 2.40(2H, m, H-6α, 6β), 2.19 (1H, d,J= 13.0 Hz, H-3α), 2.11(1H, m, H-11α), 2.00 (1H, m, H-7β), 2.42 (1H，m, H-7α), 1.96 (1H, m, H-2α), 1.95 (1H, m, H-1α), 1.92 (1H,m, H-12α), 1.80 (1H, m, H-12β), 1.78 (1H, m, H-11β),1.56 (1H, m, H-2β), 1.35 (1H, brd,J= 12.5 Hz, H-5β),1.24 (3H, s, H-19β), 1.21 (1H, m, H-1β), 1.14 (3H, s,H-17), 1.07 (1H, d,J= 4.2 Hz, H-3β), 1.04 (3H, s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 204.5 (C-14),181.0 (C-18), 165.2 (C-9), 143.4 (C-15), 130.1 (C-8),113.1 (C-16), 53.1 (C-5), 47.3 (C-13), 44.4 (C-4), 40.9(C-10), 38.2 (C-3), 37.1 (C-1), 34.6 (C-12), 28.7 (C-19),26.3 (C-7), 22.2 (C-17), 22.1 (C-6), 20.7 (C-11), 20.2 (C-2), 17.8 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[13]，故鑒定該化合物為melanocane E。

化合物8：白色無定形粉末。[α]20D?40.4 (c0.10,MeOH)；, 2909, 1696, 1639, 1416, 1265,814。HR-ESI-MSm/z: 287.164 1 [M－H]?，理論值為287.165 3，推測分子式為C18H24O3，不飽和度為7。1H-NMR（表1）顯示有2 個角甲基 [δH1.12 (s), 1.27(s)] 和1 個雙鍵相連甲基 [δH2.14 (s)] 的存在。通過13C-NMRδC122.7 (C-8), 147.2 (C-9), 116.6 (C-11),127.4 (C-12), 120.3 (C-13), 151.7 (C-14) 6 個C 信號可以確定苯環的存在，δH6.73 (J= 8.4 Hz), 6.84 (J= 8.4 Hz) 為苯環上的2 個相鄰質子。通過HMBC（圖1）中δH6.84 (J= 8.4 Hz) 與C-9、C-11 和C-14 信號相關，δH6.73 (J= 8.4 Hz) 與C-8、C-9 和C-13 信號相關，確定苯環氫位于11 和12 位；通過HMBC 中H-7 和H3-15 與C-14 的相關信號可推測出羥基在14 位；通過HMBC 中H3-16 與δC180.1 相關可推測羧基在17 位。根據HMBC 中δC147.2 與H-7、H-12、H-18 的相關，δC122.7 與H-6、H-7、H-11 相關，δC38.1 與H-1、H-2、H-5、H-18 的相關可進一步證實其結構。根據1H-1H COSY 中H-1 與H-2 的相關，H-2 與H-3、H-5 與H-6、H-6 與H-7、H-11與H-12 的相關，結合HMBC 中信息，可確定其平面結構（圖1）。通過NOESY 譜中H-5 與H-1β、H-7β、H-16 相關，推斷其相對構型（圖2）。結合以上數據，并與已知相似化合物[8]比對，化合物8 的結構確定為 14-hydroxy-16-devinyl-ent-pimara-8,11,13-trien-17-oic acid，經Sci-finder 檢索，是1 個新的降海松烷型二萜，命名為細柱五加酸G1。

圖1 化合物8 的結構（左）和關鍵HMBC (→)、1H-1H COSY (━) 相關（右）Fig.1 Structure (left), key HMBC (→) and 1H-1H COSY(━) correlations (right) of compound 8

圖2 化合物8 的關鍵NOESY 相關 (?)Fig.2 Key NOESY correlations (?) of compound 8

表1 化合物8 的 1H- 和 13C-NMR 數據 (600/150 MHz,CD3OD)Table 1 1H- and 13C-NMR spectroscopic data for compound 8 (600/150 MHz, CD3OD)

化合物9：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:301.216 7 [M－H]?，理論值為301.217 3，推測分子式為C20H30O2。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 4.80(1H, brs, H-17α), 4.74 (1H, brs, H-17β), 2.64 (1H, brs,H-13), 2.23 (2H, m, H-15), 2.16 (1H, d,J= 12.0 Hz, H-3), 2.05 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-16), 1.99 (1H, dd,J=11.2, 2.2 Hz, H-14), 1.87 (2H, m, H-1, 2), 1.82 (2H, m,H-6), 1.60 (2H, m, H-11), 1.52 (2H, dt,J= 3.5, 13.0 Hz,H-7), 1.46 (2H, m, H-12), 1.43 (1H, m, H-2), 1.24 (3H,s, H-19), 1.14 (1H, dd,J= 11.4, 5.0 Hz, H-14), 1.06 (H,d,J= 5.2 Hz, H-5), 1.03 (1H, d,J= 7.0 Hz, H-9), 1.00(1H, dt,J= 4.5, 13.5 Hz, H-3), 0.95 (3H, s, H-18), 0.81(1H, dt,J= 13.4, 3.6 Hz, H-1), 0.76 (1H, s, H-20)；13CNMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.4 (C-19), 155.8 (C-16),103.0 (C-17), 57.1 (C-5), 55.2 (C-9), 49.0 (C-15), 44.2(C-8), 43.9 (C-13), 43.7 (C-4), 41.3 (C-7), 40.7 (C-1),39.7 (C-14), 39.6 (C-10), 37.8 (C-3), 33.1 (C-12), 28.9(C-18), 21.8 (C-6), 19.1 (C-2), 18.4 (C-11), 15.6 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[14]，故鑒定該化合物為ent-kaur-16-en-19-oic acid。

化合物10：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 4 [M－H]?，理論值為317.212 2，推測分子式為C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 9.59(1H, d,J= 1.6 Hz, H-17), 2.62 (1H, t,J= 5.3, 9.2 Hz,H-16), 2.00～2.03 (1H, m, H-3α), 1.30～1.85 (8H, m,H-2α, 3β, 11, 12, 14α), 1.10 (3H, s, H-18), 0.86 (3H, s,H-20), 0.75～0.83 (1H, m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 203.9 (C-17), 178.6 (C-19), 56.0 (C-5), 54.6 (C-9), 52.7 (C-16), 48.6 (C-8), 44.6 (C-4), 42.9(C-7), 40.8 (C-1), 40.4 (C-15), 39.1 (C-10), 37.7 (C-13), 37.3 (C-3), 37.0 (C-14), 30.5 (C-12), 28.6 (C-18),22.2 (C-6), 18.9 (C-2), 18.3 (C-11), 15.4 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[15]，故鑒定該化合物為17-oxoent-kaur-19-oic acid。

化合物11：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 8 [M－H]?，理論值為317.212 2，推測分子式為C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 5.74(1H, dd,J= 16.8, 10.2 Hz, H-15), 5.60 (1H, brs, H-14),4.95 (1H, dd,J= 10.8, 2.4 Hz, H-16), 4.94 (1H, dd,J=16.8, 1.8 Hz, H-16), 3.87 (1H, brs, H-7), 2.80 (1H, ddd,J= 12.7, 4.7, 1.2 Hz, H-6β), 2.55 (1H, q,J= 12.7 Hz, H-6α), 2.24 (2H, dt,J= 14.0 Hz, H-3β), 2.16 (1H, m, H-9),1.86 (1H, dd,J= 9.6, 7.8 Hz, H-5), 1.79 (1H, dt,J= 13.8,4.8 Hz, H-2β), 1.73 (1H, brd,J= 13.2 Hz, H-1β), 1.59(2H, m, H-11β, 12β), 1.44 (1H, dq,J= 14.4, 4.2 Hz, H-2α), 1.25 (3H, s, H-18), 1.25～1.36 (2H, m, H-11α,12α), 1.12 (1H, m, H-3α), 1.11 (1H, ddd,J= 13.2, 13.2,6.6 Hz, H-1α), 1.04 (3H, s, H-17), 0.67 (3H, s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 181.1 (C-19), 148.2 (C-15), 141.6 (C-8), 125.8 (C-14), 113.5 (C-16), 73.4 (C-7),54.1 (C-5), 50.0 (C-9), 44.6 (C-10), 40.2 (C-4), 40.1 (C-1), 39.1 (C-3), 39.0 (C-13), 36.5 (C-12), 34.9 (C-6), 29.7(C-17), 29.4 (C-18), 20.6 (C-2), 20.3 (C-11), 14.3 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[7]，故鑒定該化合物為7αhydroxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物12：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.195 8 [M－H]?，理論值為315.196 6，推測分子式為C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 9.73(1H, s, H-17), 6.57 (1H, s, H-15), 3.04 (1H, d,J= 3.6 Hz, H-13), 2.17 (1H, d,J= 10.8 Hz, H-3α), 1.26 (3H,s, H-18), 1.00 (3H, s, H-20), 0.83 (1H, td,J= 16.8, 12.6 Hz, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 189.3 (C-17), 182.2 (C-19), 161.3 (C-15), 148.7 (C-16), 56.6 (C-5), 50.9 (C-9), 46.0 (C-8), 43.7 (C-4), 43.0 (C-7), 40.6(C-1), 40.1 (C-10), 38.2 (C-14), 37.9 (C-13), 37.8 (C-3), 28.9 (C-18), 25.1 (C-12), 20.2 (C-6), 19.0 (C-2), 18.7(C-11), 15.5 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[16]，故鑒定該化合物為17-oxo-ent-kaur-15-en-19-oic acid。

化合物13：白色無定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 2 [M－H]?，理論值為317.212 2，推測分子式為C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.37(1H, d,J= 10.3 Hz, H-15), 4.19 (2H, d,J= 2.0 Hz, H-16), 2.54～2.58 (1H, m, H-13), 2.10 (1H, m, H-3α),1.23 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-20), 0.80～0.94 (1H,m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 182.4 (C-19), 146.4 (C-16), 135.9 (C-15), 61.7 (C-17), 57.1 (C-5), 49.3 (C-8), 48.0 (C-9), 44.3 (C-7), 44.0 (C-4), 41.5(C-13), 41.1 (C-1), 40.2 (C-10), 39.6 (C-14), 38.4 (C-3),29.3 (C-18), 25.9 (C-12), 21.1 (C-6), 19.5 (C-2), 19.3 (C-11), 15.8 (C-20)。以上數據與文獻報道一致[16]，故鑒定該化合物為17-hydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid。

3.2 抗炎活性篩選結果

3.2.1 單體化合物對細胞RAW264.7 細胞活力的影響 與空白對照組相比，13個化合物濃度在3.125～100 μmol/L，細胞活力在80%以上，無顯著性差異，可認為在3.125～100 μmol/L 受試樣品未出現細胞毒性，因此實驗選擇在此質量濃度比較不同樣品的抗炎作用的優劣。

3.2.2 單體化合物對LPS 刺激RAW264.7 細胞中NO 的含量測定 為了明確五加皮中分離得到的單體化合物的抗炎作用，采用MTT 法進行了細胞毒性實驗，空白對照組的細胞存活率為100%。與LPS組相比，8 種化合物均具有抗炎活性，化合物1～3、7 具有較強的抗炎活性，并且化合物1～5、7、9、10 隨著質量濃度的增加，NO 的含量減少，抗炎活性增強；化合物6、9 質量濃度在25～100 μmol/L 時有抗炎活性，低質量濃度時并未發揮抗炎活性（圖3）。

圖3 13 個化合物對NO 釋放的抑制情況 (n = 3)Fig.3 Inhibitory activities of 13 compounds (n = 3)

4 討論

從五加皮中共得到13 個二萜類化合物，分別為7 個海松烷型二萜化合物1～4、7、8、11，以及6個貝殼杉烷型二萜化合物5、6、9、10、12、13。化合物8 為1 個新的降海松烷型二萜，化合物3 和4為在首次該植物中發現。

體外抗炎活性研究發現，海松烷型二萜的抗炎活性普遍高于貝殼杉烷型類化合物。對海松烷型二萜抗炎作用結果進行比較發現，這類化合物7 位取代活性順序為β-OH＞β-OCH3＞Δ6雙鍵＞C=O＞α-OH（活性順序為1＞3＞4＞2＞11）。

本實驗分離鑒定的五加皮二萜類化合物及其活性研究，為五加皮藥材及制劑的質量控制方法建立、藥用資源合理開發和利用提供了依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突