基于代謝組學的痹祺膠囊治療類風濕性關節炎作用機制研究

韓彥琪 ，姚鵬飛 ，卜睿臻，許 浚 ，王 磊，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現代制劑與質量控制技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統轉化全國重點實驗室，天津 300462

4.天津中醫藥大學，天津 301617

5.天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，天津 300112

6.津藥達仁堂集團股份有限公司，天津 300193

痹祺膠囊由馬錢子、地龍、黨參、茯苓、白術、川芎、丹參、三七、牛膝、甘草10 味藥材組成，具有益氣養血、祛風除濕、活血止痛的功效，用于氣血不足、風濕瘀阻、肌肉關節酸痛，關節腫大、僵硬變形或肌肉萎縮，氣短乏力；風濕、類風濕性關節炎，腰肌勞損，軟組織損傷屬上述證候者。多項臨床研究表明痹祺膠囊治療類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）效果良好，且不良反應較少，是治療RA 安全有效的方藥[1-7]。

代謝組學是系統生物學中一種關鍵的研究技術和方法，當機體受到病原、環境等刺激產生病變時，內源性物質發生相應的代謝響應，這種代謝產物的變化表達成為疾病相關的代謝物組，通過對機體的血清、尿液、糞便、細胞提取物等不同類型的樣本中的內源代謝成分進行表征，得到含有代謝產物信息的代謝指紋圖譜，并利用多元數據分析方法對信息進行挖掘提取，獲取機體在不同生理或疾病狀態下的生物標志物，進一步分析機體內源性代謝機制，探討疾病的內在代謝循環途徑和信號通路，為探討疾病的發病過程和機制提供參考，同時進一步剖析藥物作用機制與作用位點的相關信息，闡釋藥物作用機制[8-10]。本研究采用超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術，鑒定與痹祺膠囊干預RA 相關的潛在生物標志物，基于標志物所在的代謝通路，探討痹祺膠囊治療RA 的作用機制。

1 材料

1.1 藥物

痹祺膠囊（天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，國藥準字Z10910026，規格0.3 g/粒，批號311574）；醋酸潑尼松片（新鄉市常樂制藥有限責任公司，規格5 mg/片，批號21020162）；雷公藤總苷片（上海復旦復華藥業有限公司，規格10 mg/片，批號180502）。

1.2 動物

SPF 級Sprague-Dawley 雄性大鼠，體質量（120±10）g，由北京斯貝福生物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010，動物實驗獲天津天誠新藥評價有限公司實驗動物倫理委員會批準（IACUC：No.2021031803），動物飼養環境（23±3）℃，12 h 晝夜交替，自由進食飲水。

1.3 主要試劑及儀器

雞 II 型膠原蛋白（Chondrex 公司，批號200323）；乙腈（Fisher Chemical 公司，批號F21LCL201）；甲酸（Dikma 公司，批號4313887）。

MD200-1A 型氮吹儀（上海登晨生物醫療科技有限公司）；Thermo Mixer C 型恒溫混勻儀（Thermo公司）；TGL-18R 型離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；Ultimate 3000 型液相色譜儀（Thermo 公司）；Q-Exactive 型質譜儀（Thermo 公司）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

SD 大鼠適應性喂養1 周后，隨機選擇10 只為空白組，其余大鼠在左側足跎肉墊處皮內注射雞II型膠原蛋白（0.1 mL/只），空白組注射等體積生理鹽水。在第1 次注射免疫的第7 d，在背部注射相同乳劑0.1 mL 加強免疫[11-12]，觀察大鼠狀態至造模15 d，篩選雙側關節出現炎癥腫脹的大鼠隨機分為模型組、潑尼松組（10 mg/kg）、雷公藤總苷組（10 mg/kg）、痹祺膠囊組（BQH，0.4 g/kg，臨床等效劑量），每組10 只。各給藥組連續ig 給藥15 d，空白組及模型組予以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液。末次給藥前禁食不禁水12 h 以上，末次給藥結束1 h后，麻醉，腹主動脈采血，4 ℃下3000 r/min 離心10 min，取上清液即為血清，置?80 ℃冰箱備用。

2.2 血清及質控（quality control，QC）樣本處理

將血清樣本取出，4 ℃下解凍，分別取45 μL血清于EP 管，向每個樣本中加入180 μL 乙腈，渦旋1 min，以4 ℃、14 000 r/min 離心15 min，每個樣本取45 μL 混合作為QC，每個樣本和QC 取135μL 于96 孔板中，氮氣吹干，加入70 μL 50%乙腈復溶，4 ℃、14 000 r/min 離心15 min，每個樣本取65 μL 上清液進樣。樣本在進樣的分析過程中，為監測LC-MS 系統的穩定性，每進5 針樣品進1 針QC 樣品。

2.3 LC-MS 分析條件

2.3.1 色譜條件 Phenomenex Kinetex C18（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）色譜柱；柱溫40 ℃；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：1～12 min，5%～60% B；12～13 min，60%～100% B；13～16 min，100% B；16～17 min，100%～5% B；17～20 min，5% B；體積流量0.3 mL/min；進樣體積3 μL。

2.3.2 質譜條件 Q Exactive MS 質譜儀，用HESI離子化方式，正、負離子模式掃描，鞘氣體積流量35 arb，輔助氣體積流量10 arb，噴霧電壓3.5 kV，毛細管溫度為275 ℃，加熱器溫度350 ℃，S-lens RF level 50%。輪廓譜分析采用全掃描模式，質量掃描范圍為m/z80～900，分辨率70 000 FWHM，自動增益控制目標（AGC target）1×106。結構鑒定采用全掃描/數據依賴二級掃描（full scan/dd MS2）模式，分辨率17 500 FWHM，AGC target 2×105，離子隔離窗口（isolation window）2.0，歸一化碎裂能量（stepped NCE）50%，動態排除（dynamic exclusion）6 s。

2.4 數據處理

將通過UPLC-Q-TOF-MS 所采集的原始圖譜導入到XCMS 軟件進行峰對齊、峰提取、歸一化、去卷積等預處理，得到1 個含有保留時間、m/z、峰面積信息的三維矩陣。通過R 語言對歸一化后的峰面積進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），以變量投影重要性（variable importance for projective，VIP）≥1.0，差異倍數（fold-change，FC）≥2 或≤0.5 和P＜0.01為標準篩選出潛在的生物標志物。

2.5 代謝標志物鑒定及通路分析

代謝標志物定性分析根據同位素峰相對比值確定化合物元素組成，搜索HMDB、PubChem、ChemSpider、Lipid Maps、MassBank、KEGG 等數據庫對代謝物進行檢索，根據二級質譜離子碎片、化學鍵斷裂規律及相關文獻查閱確定代謝標志物結構。

利用MetPA 數據庫聯合多個高級的路徑分析程序對鑒定得到的血液代謝標志物的相關代謝通路進行拓撲特征分析，將通路影響值（pathway impact）＞0.05 的代謝通路作為潛在靶標代謝通路。

3 結果

3.1 QC 分析

QC 樣本PCA 結果見圖1。QC 樣本可以相對聚集在一起，聚集越好表明儀器檢測狀態越穩定，采集的數據質量越好。經過PCA，QC 樣本在2 個采集模式下都比較聚集，數據采集質量較好，QC 結果合格。

圖1 QC 樣本PCAFig.1 PCA of QC samples

3.2 代謝物輪廓分析

通過UPLC-Q-TOF-MS 分析，獲得不同組別大鼠血清樣品在正、負離子模式下的代謝指紋譜，如圖2 所示。為了更好揭示組間差異及代謝輪廓，采用OPLS-DA 進行數據分析，結果見圖3。空白組、模型組和痹祺膠囊組均聚集在95%的置信區間內，各聚為一類?？瞻捉M與模型組分布于不同象限區域內，且組內樣品聚集良好，表明建立RA 模型后，大鼠內源性小分子代謝物發生顯著變化，模型復制成功。痹祺膠囊給藥干預后，整體上遠離模型組，向空白組靠攏的趨勢明顯，表明痹祺膠囊對RA 大鼠的治療效果顯著。

圖2 大鼠血清代謝指紋圖譜Fig.2 Serum metabolic fingerprint of rats

圖3 空白組 (C)、模型組 (M) 和痹祺膠囊組 (BQH) PLS-DA 圖Fig.3 PLS-DA analysis diagram of blank group (C), model group (M) and Biqi Capsules (BQH) group

3.3 生物標志物的篩選及鑒定

將模型組和空白組、痹祺膠囊組和模型組大鼠血清的質譜數據進行單變量、多變量分析（PLSDA）。圖4 分別展示了正、負模式下的火山圖，FC≤0.5 且P＜0.01 的點用綠色標識；FC≥2 且P＜0.01 的點用紅色標識，其余點為黑色，圖中所示虛線為一般篩選標準線。圖5 分別展示了正、負模式下的PLS-DA 模型（參數見表1），可以看出空白組和模型組能完全分開，說明兩組大鼠血液代謝產物差異明顯。在OPLS-DA 基礎上進行S-plot 分析，選擇VIP 值≥1.0 且P＜0.01，FC≥2 或FC≤0.5 的變量，對潛在差異代謝標志物進行結構驗證，最終表征了18 個RA 血液差異代謝標志物，其中正離子模式下9 個，負離子模式下9 個，分析發現其中8 個代謝差異物表現為不同程度的下調，10 個表現為不同程度的上調，詳細信息見表2。對18 個生物標志物的相對含量研究發現（圖6、7），與模型組相比，痹祺膠囊組對14 個生物標志物產生了逆轉作用，除對6-硫代鳥苷一磷酸、3-(3-羥基苯基)丙酸、三氯乙醇葡萄糖醛酸、吲哚乙酸4 個生物標志物的作用沒有統計學差異外，其余14 個生物標志物可以被其完全逆轉（FC≥2 或FC≤0.5 且P＜0.01），見表2。

表1 PLS-DA 模型參數Table 1 PLS-DA model parameters

表2 血清中差異代謝物鑒定結果Table 2 Identification of differential metabolites in serum

圖4 大鼠血清代謝物火山圖Fig.4 Volcano plots for metabolites in serum of rats

圖5 PLS-DA 得分圖Fig.5 Score plot of PLS-DA

圖6 痹祺膠囊給藥后對RA 大鼠血清生物標志物含量變化的影響 (±s , n=10)Fig.6 Effect of biomarkers levels in serum of RA rats after administration with Biqi Capsules (±s , n=10)

圖7 各組潛在生物標志物熱圖Fig.7 Heat map of potential biomarkers in different groups

3.4 痹祺膠囊干預RA 的代謝通路分析

利用MetPA 數據庫聯合多個高級的路徑分析程序對表2 中鑒定得到的18 個血液代謝標志物的相關代謝通路進行拓撲特征分析，將通路影響值＞0.05 的11 條代謝通路作為潛在靶標代謝通路，包括（1）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；（2）苯丙氨酸代謝；（3）醚脂代謝；（4）組氨酸代謝；（5）三羧酸循環；（6）精氨酸生物合成；（7）精氨酸和脯氨酸代謝；（8）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；（9）藥物代謝-其他酶類；（10）丙酮酸代謝；（11）嘌呤代謝。見圖8。

圖8 潛在生物標志物代謝通路富集Fig.8 Enrichment of metabolic pathways of potential biomarkers

4 討論

本研究以RA 模型大鼠為研究對象，探究痹祺膠囊治療RA 的作用機制。利用UPLC-Q-TOF-MS技術對大鼠血清進行代謝組學分析，篩選潛在生物標志物，并富集相關代謝通路，闡釋痹祺膠囊作用機制。共篩選鑒定出18 個差異代謝物與RA 密切相關，且痹祺膠囊能顯著回調這些潛在生物標記物，通過信號通路富集分析發現，痹祺膠囊主要通過調節花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝、與能量代謝相關的三羧酸循環等代謝途徑發揮治療作用（調控網絡見圖9）。

圖9 痹祺膠囊調控RA 的代謝網絡Fig.9 Metabolic network of Biqi Capsules regulating RA

4.1 花生四烯酸代謝

花生四烯酸是人體中一種重要的脂肪酸，可通過環氧化酶（cyclooxygenase，COX）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）催化生成多種致炎因子，如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、血栓素（thromboxane，TXB）等，介導或調節RA 的炎癥反應，增加血管彈性，調節血細胞功能[13]本研究發現，在RA 大鼠血清中花生四烯酸代謝產生的前列腺素F2α 與12-酮-白三烯B4含量顯著升高。研究表明前列腺素F2α 可抑制血管平滑肌舒張，導致瘀血疼痛[14]12-酮-白三烯B4是白三烯家族中一個重要的炎癥調節因子，LTB4可激活T 淋巴細胞釋放多種細胞因子產生炎癥反應；同時通過抑制中性粒細胞凋亡，誘導其定向遷移、致關節疼痛和骨損傷、調控免疫細胞分化，致使RA 患者出現關節炎癥、腫痛、骨質破壞等癥狀[15-16]。經痹祺膠囊給藥干預后，前列腺素F2α與12-酮-白三烯B4含量顯著下降，表明痹祺膠囊可通過調節花生四烯酸代謝途徑，降低炎癥因子表達，發揮抗炎止痛、活血化瘀的作用。

4.2 甘油磷脂代謝

溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）是由甘油磷脂類化合物經磷酸酯酶A2 水解得到的主要產物之一，在細胞增殖和炎癥反應中均起著重要作用。LPC 與G 蛋白偶聯受體結合可誘導T 淋巴細和巨噬細胞的遷移，促進致炎細胞因子的產生，誘導氧化應激，促進細胞凋亡，從而聚集炎癥[17]。研究表明，在RA 的發病機制中，脂質介質起著至關重要的作用，LPC 主要參與調節免疫、誘導致炎因子的產生，促進炎癥反應，其中LysoPC(O-18:0/0:0) 表現出一定的致炎作用[18-19]。本研究發現，在RA 大鼠血清中LysoPC(O-18:0/0:0) 含量顯著升高，經痹祺膠囊干預后顯著降低，可見痹祺膠囊可通過調控甘油磷脂代謝途徑，抑制LPC 的代謝生成，從而發揮抗炎作用。

4.3 氨基酸代謝

氨基酸代謝途徑紊亂與滑膜炎癥反應密切相關。L-苯丙氨酸可以在苯丙氨酸羥化酶作用下生成酪氨酸；酪氨酸也是合成兒茶酚胺的前體，其可在酪氨酸羥化酶、巴胺羥化酶等多種酶的催化作用下生成兒茶酚胺[20-21]。兒茶酚胺與免疫細胞表面受體結合，抑制細胞免疫和體液免疫，與β 腎上腺素能受體結合可發揮抗炎效應[22]。在RA 中，淋巴細胞的內源性兒茶酚胺具有抑制輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17）/調節性T 細胞（regulatory T cells，Treg）失衡、促進Th1 細胞向Th2 細胞方向分化，減輕關節炎癥及骨損傷的作用[23-24]。本研究發現在RA 大鼠血清中L-苯丙氨酸含量顯著增加，此外其下游代謝物馬尿酸和二甲基馬尿酸含量明顯升高，由此可推測L-苯丙氨酸-酪氨酸-兒茶酚胺代謝途徑可能受到阻礙。經痹祺膠囊干預后，L-苯丙氨酸、馬尿酸和二甲基馬尿酸含量顯著回調，可能會使免疫系統發生調節改變。

研究表明，在RA 的關節滑液中的谷氨酸濃度與關節腫脹程度、骨侵蝕及痛覺的敏感度密切相關，其能刺激滑膜成纖維細胞的增殖，破壞關節軟骨，同時引起巨噬細胞釋放多種細胞因子促進炎癥反應[25-26]。同時谷氨酸會參與脫氫抗壞血酸的轉運，其在RA 患者血清中濃度顯著升高，可能反映了RA 中維生素的抗氧化和清除自由基活性增加，與關節炎癥程度有關[27-28]。谷氨酸能被谷氨酰胺合成酶酰胺化為谷氨酰胺，或經脫氨基轉化為α-酮戊二酸[29]。本研究發現，在RA 大鼠血清中，α-酮戊二酸含量顯著下降，痹祺膠囊干預后顯著回調，表明痹祺膠囊通過調節谷氨酸代謝途徑緩解炎癥反應，從而抑制滑膜細胞增殖及軟骨破壞。

研究發現RA 患者的血清、軟骨組織和滑膜細胞中誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和NO 呈現高表達，精氨酸在體內代謝主要是在NOS 的催化下代謝產生NO，可刺激T 淋巴細胞的增生并釋放細胞因子，促進炎癥發展[30-31]。本研究發現在RA 大鼠血清中L-精氨酸含量顯著下降，經痹祺膠囊給藥后其含量顯著回升，表明可通過調節精氨酸代謝途徑抑制NO 生成，發揮抗炎作用。

4.4 三羧酸循環

三羧酸循環作為有氧代謝過程的中心代謝途徑，是機體獲得能量的主要方式，是糖類、脂類、氨基酸的代謝聯系的樞紐和最終代謝通路。三羧酸循環過程中相關的中間代謝物與酶參與炎癥及免疫調節，與多種人類疾病相關[32-33]。研究發現RA 患者體內三羧酸循環的中間產物α-酮戊二酸、蘋果酸和檸檬酸會降低[34]。α-酮戊二酸能夠增加M2/M1巨噬細胞極化的比例，發揮抗炎作用[35-36]。α-酮戊二酸、蘋果酸等含量降低，意味著RA 患者的有氧代謝受阻，而糖降解途徑增強，進一步促進滑膜細胞的快速增殖[37]。同時，三羧酸循環受阻后也會引發氧化應激，RA 患者滑膜組織缺氧的狀態會刺激自身免疫組織活化以及滑膜細胞的分化，同時引起炎癥及氧化損傷[38]。本研究發現，模型組中α-酮戊二酸和蘋果酸水平顯著下降，說明RA 模型中三羧酸循環途徑受阻，經痹祺膠囊治療后，α-酮戊二酸和蘋果酸顯著回調，表明其可通過干預三羧酸循環，調節糖類的有氧代謝途徑，進而發揮抗炎、抑制滑膜增殖及氧化損傷作用，最終實現對RA 的治療作用。

綜上分析，痹祺膠囊可通過調節花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝（L-苯丙氨酸、谷氨酸、精氨酸）、三羧酸循環能量代謝等代謝途徑，改善內源性代謝物的水平，在機體供能、抗炎及免疫調節過程中發揮作用，從而達到對RA 的治療效果。本研究從代謝組學的角度篩選了痹祺膠囊治療RA 的潛在生物標志物，解析了其作用機制，為進一步機制研究奠定基礎，同時也為痹祺膠囊的臨床合理用藥提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突