痹祺膠囊對類風濕性關節炎關鍵靶點的調節作用

韓彥琪 ，宋紫騰 ，姚鵬飛 ，張祥麒，許 浚 ，王 磊，趙專友 ，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現代制劑與質量控制技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統轉化全國重點實驗室，天津 300462

4.天津中醫藥大學，天津 301617

5.天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，天津 300112

6.津藥達仁堂集團股份有限公司，天津 300193

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、系統性、炎癥性自身免疫性疾病，屬于中醫“痹病（證）”范疇。主要表現為對稱性、慢性、進行性多關節炎。RA 的基本病理特征是滑膜炎癥，由于關節滑膜細胞增生，形成血管翳，進而侵犯關節軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌鍵等，造成關節軟骨、骨關節囊破壞，最終導致關節畸形和功能喪失，嚴重時甚至可致殘疾，對患者的生活造成不利影響。現代醫學表明，RA 患者伴有炎癥、血瘀、軟骨損傷等癥狀[1]。

痹祺膠囊由馬錢子、地龍、黨參、茯苓、白術、川芎、丹參、三七、牛膝、甘草10 味藥材組成，具有益氣養血、祛風除濕、活血止痛的功效。臨床研究表明，痹祺膠囊對RA 具有顯著的治療效果[2-5]，但對其作用機制的研究還不全面。為探究痹祺膠囊的關鍵作用靶點并明晰其藥效物質基礎，本研究在前期化學物質組、血中移行成分[6]及網絡藥理學研究的基礎上并結合相關文獻，選取了10 味藥材中各結構類型的主要代表性成分共19 個化合物為研究對象，同時以與抑制滑膜炎癥相關的受體[環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、趨化因子受體4（C-C chemokine receptor type 4，CCR4）]，與活血相關的受體[凝血酶、磷酸二酯酶（ cGMP-inhibited 3′,5′-cyclic phosphodiesterase，PDE3A）、腎上腺素受體 α1（alpha-1A adrenergic receptor，ADRA1A）]，與抑制血管翳生成相關的受體[血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor 2，

VEGFR2/KDR）]，以及與抑制基質降解相關的受體基質金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）9 個關鍵靶點為研究載體，通過運用胞內鈣離子熒光檢測和酶抑制劑檢測技術評價痹祺膠囊中19 個主要單體成分對9 個關鍵靶點的抑制活性。

1 材料

1.1 藥品與試劑

QUANTI-Blue?檢測試劑（批號QBS-4222）、丙磺舒（批號2157171）購自美國InvivoGen 公司；細胞活力熒光檢測試劑盒（批號0000424721）購自美國Promega 公司；G418（批號2121442）購自美國Gibco 公司；星形孢菌素（批號S142105）購自Selleckchem 公司；Fluo-4 Direct 試劑盒（批號2325989）、HBSS（批號2193007）、HEPES（批號2192573）購自美國Invitrogen 公司；人凝血酶（批號 F1900752 ）、BIOPHEN CS-11(38) （ 批號F2000197）購自HYPHEN BioMed 公司；KDR（批號07CBS-0540）購自Carna 公司；Peptide FAM-P22 GL（批號P180116-MJ112393）購自Biochem 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號WXBD820V4）、阿加曲班（批號141396-28-3）、腎上腺素（批號 WXBD1853V）、WB4101（批號117H46492）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，批號 987-65-5）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號474382）、EDTA（批號60-00-4）購自美國Sigma 公司；FLIPR?Calcium 4 assay kit（批號3233461）、IMAP FP IPP Explorer Kit（批號MD167386）、羧基熒光素標記的環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP，批號2873747）購自Molecular Devices 公司；PDE3A（批號110802HEGE）購自BPS 公司；Dipyridamole（批號15979）購自美國MCE 公司；人TARC/CCL17（批號M2106001）購自Genscrip 公司；C-021（批號2A/249015）購自Tocris 公司；OptiPlate TM-384黑色微孔板（批號 8240-18341）購自美國PerkinElmer 公司；COX-2 抑制劑檢測試劑盒（批號041421210419）購自上海碧云天生物技術有限公司；NOS 抑制劑檢測試劑盒（批號7G26K02080）購自BioVision 公司；MMP-3 抑制劑檢測試劑盒（批號GR3381906-1）購自英國Abcam 公司；19 個單體化合物信息見表1。

表1 19 個單體化合物信息Table 1 Information of 19 monomer compounds

1.2 細胞

HEK-Dual? TNF-α 細胞、穩定表達CCR4 受體的HEK293 細胞購自上海藥明康德新藥開發有限公司；穩定表達ADRA1A 受體的CHO-K1 細胞購自上海睿智化學研究有限公司。

1.3 儀器

FlexStation 3 型多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；TC20 型細胞計數儀（美國Bio-Rad公司）；CKX41SF 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Echo550 型超聲波納升液體處理系統（美國Labcyte 公司）；EZ Reader II 型激酶檢測儀/微流控系統（美國Perkin Elmer 公司）；AllegraTM25R 型離心機（美國Beckman 公司）；3111 型CO2培養箱（美國Thermo 公司）。

2 方法

2.1 抑制滑膜炎癥相關靶點抑制實驗

2.1.1 COX-2 抑制活性實驗 取適量待測樣品，用DMSO 將化合物配制成0.2、2 mmol/L 檢測濃度的溶液（終濃度為10、100 μmol/L）。以塞來昔布為陽性對照，以100 μmol/L 的起始濃度（終濃度5 μmol/L），在DMSO 中5 倍連續梯度稀釋8 個點。按照試劑盒說明書進行操作，計算每個樣品的抑制率。

抑制率＝(RFU100%酶活性對照－RFU樣品)/(RFU100%酶活性對照－RFU空白對照)

2.1.2 NOS 抑制活性實驗 取適量待測樣品，用緩沖液將化合物配制成40、400 μmol/L（終濃度為10、100 μmol/L ），以二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）為陽性對照，以200 μmol/L 的起始濃度（終濃度50 μmol/L），用緩沖液5 倍連續梯度稀釋8 個點。按照試劑盒說明書進行操作，計算抑制率。

2.1.3 NF-κB 拮抗實驗 將10 μL 終濃度為10、100 μmol/L 的待測樣品加入到96 孔板，參考化合物腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）最高質量濃度為1000 ng/mL，3 倍梯度，共9 個質量濃度，陰性對照孔（NC）和陽性對照孔（PC）每孔加入10 μL 培養基（DMSO 終體積分數為0.5%）。然后按照5×104個/孔將80 μL HEK-Dual? TNF-α細胞接種于已加好待測樣品的96 孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱共孵育2 h 后，PC 組每孔加入10 μL培養基，其余組每孔加入10 μL 200 ng/mL 的TNFα（終質量濃度20 ng/mL），離心后在37 ℃、5% CO2培養箱共孵育24 h。每孔取20 μL 細胞上清，加入含有180 μL QUANTI-Blue?試劑的實驗板中，37 ℃孵育1 h 后，用多功能酶標儀SpectraMax M2e 檢測650 nm 的吸光度（A）值。按照Celltiter-Glo 說明書方法操作，化學發光信號（RLU）用多功能酶標儀synergy2 檢測。

化合物抑制活性＝(A化合物－ANC)/(APC－ANC)

細胞活性＝RLU化合物/RLUPC

2.1.4 CCR4 拮抗實驗 穩定表達CCR4 受體的HEK293 細胞（DMEM＋10%胎牛血清、300 μg/mL G418、2 μg/mL BS），以1×106個/mL 接種于多聚賴氨酸包被的384 孔板，5% CO2、37 ℃培養箱孵育過夜。

（1）80%有效濃度（80% effective concentration，EC80）檢測：去除細胞板中培養液，每孔加入20 μL檢測緩沖液（20 mmol/L HEPES、1×HBSS、0.5%BSA），再加入20 μL Fluo-4 檢測試劑，37 ℃孵育50 min，室溫靜置10 min。將激動劑人TARC/CCL17用檢測緩沖液3 倍稀釋成10 個濃度并轉移到EC80檢測化合物板中，每孔30 μL（起始濃度為1μmol/L）。啟動儀器，從化合物板中轉移10 μL 激動劑到細胞板中，讀數，計算EC80。

（2）化合物拮抗活性檢測：將19 個化合物用DMSO 稀釋為2 mmol/L 溶液（終濃度為10、100 mmol/L），將陽性拮抗劑C-021 進行3 倍稀釋成10個濃度（起始終濃度50 mmol/L），用Echo 分別轉移900 nL 到CCR4 化合物板中，每孔加入30 mL 檢測緩沖液。去除細胞板中培養液，每孔加入20 mL檢測緩沖液，然后再加入20 mL Fluo-4 檢測試劑。用FLIPR 轉移10 mL 化合物至細胞板中，37 ℃孵育50 min，室溫靜置10 min。配制CCR4 的EC80并加入到EC80板中，每孔30 mL。從EC80板中轉移10 mL 化合物到細胞板中，讀數，計算各化合物抑制率。

抑制率＝100－(RLU－LC)/(DMSO－LC)

RLU 為相對A值，1 至Maximum allowed 的讀值；DMSO為DMSO 組熒光信號平均值；LC 為拮抗劑最高濃度點熒光信號平均值

2.2 抑制血管翳形成相關靶點抑制實驗

將FAM 標記的底物多肽和ATP 加入1 倍激酶緩沖液[（50 mmol/L HEPES、pH 7.5、0.001 5%聚氧乙烯月桂醚-35（Brij-35）]，形成2.5 倍底物溶液。用DMSO 配制19 個待測化合物儲液，用激酶緩沖液稀釋成5 倍檢測濃度（終濃度為10、100 μmol/L）。陽性抑制劑星形孢菌素最高檢測濃度為1 μmol/L，3 倍稀釋，10 個濃度點。取5 μL 的5 倍濃度陽性對照及待測樣品到384 孔反應板，空白對照組加5 μL DMSO。加入10 μL 2.5 倍激酶溶液，陰性對照孔加入等體積1 倍激酶緩沖液，室溫下孵育10 min。加入10 μL 2.5 倍底物溶液，28 ℃孵育60 min 后加入35 μL 終止液終止反應。激酶檢測儀讀取轉化率數據，計算抑制率。

2.3 抑制基質降解相關靶點抑制實驗

取適量待測樣品，用DMSO 將化合物配制成一定濃度的母液，用乙醇稀釋到1、10 mmol/L 檢測濃度的溶液（終濃度為10、100 μmol/L）。以NNGH 為陽性對照，以1300 μmol/L 的起始濃度（終濃度13 μmol/L），在DMSO 中10 倍連續梯度稀釋8 個點。按照試劑盒說明書操作。

2.4 活血作用相關靶點抑制實驗

2.4.1 凝血酶抑制活性實驗 以阿加曲班為陽性對照，以2 mmol/L的起始濃度（終濃度200 μmol/L），在DMSO 中5 倍連續梯度稀釋8 個點，轉移6 μL到96 孔反應板中；待測樣品轉移6 μL 到反應板中，化合物終濃度為10、100 μmol/L，空白對照孔及100%酶活性對照孔每孔加入6 μL DMSO。配制含0.05 mol/L Tris buffer、0.3 mol/L NaCl、pH 7.8 的緩沖液，100%酶活性對照孔、陽性對照組及樣品組各加入42 μL，空白對照組加入48 μL。用緩沖液將凝血酶（FIIa）稀釋為工作濃度3 NIH/mL（終濃度0.3 NIH/mL），100%酶活性對照孔、陽性對照組及樣品組各加入6 μL，37 ℃孵育5 min。用緩沖液將底物稀釋為工作質量濃度2.5 mg/mL（終質量濃度0.25 mg/mL），向每組各加入6 μL，37 ℃孵育5 min，在405 nm 檢測A值，計算抑制率。

2.4.2 PDE3A 抑制活性實驗 5 倍反應緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.2、10 mmol/L MgCl2、0.05%NaN3、0.01%聚山梨酯-20、1 mmol/L DTT）；反應終止液（5 倍IMAP progressive binding A 溶液、5 倍IMAP progressive binding B 溶液、IMAP progressive binding bead）。陽性抑制劑曲喹辛最大給藥濃度為0.1 μmol/L，3 倍梯度稀釋，共10 個給藥濃度，待測化合物給藥濃度為10、100 μmol/L。

將化合物用DMSO 在Echo384 孔板上稀釋到所需要的濃度，用Echo550 儀器從Echo384 孔板中轉移200 nL 樣品到384 反應板中，陰性對照（加酶組）和陽性對照（不加酶組）均轉移200 nL 的100%DMSO。將PDE3A 加入1 倍反應緩沖液，形成終質量濃度為0.075 μg/mL 的2 倍酶溶液。將FAM 標記的cGMP 加入1 倍反應緩沖液，形成2 倍底物溶液。向384 孔反應板孔中加入10 μL 的2 倍酶溶液，對于無酶活對照孔，用10 μL 的1 倍反應緩沖液替代酶溶液，1000 r/min 離心1 min，室溫下孵育15 min，每孔中加入10 μL 的2 倍底物溶液，1000 r/min離心1 min，室溫反應30 min，每孔中加入60 μL 的反應終止液終止反應，室溫下搖床600 r/min 振蕩避光孵育 60 min。用酶標儀讀數，參數設置Ex480/Em535(s)，Em535(p)，計算抑制率。

2.4.3 ADRA1A 受體拮抗活性實驗 以腎上腺素和WB4101 為陽性激動化合物和陽性拮抗化合物，最高檢測濃度為4 μmol/L，4 倍稀釋，10 個濃度點。19 個化合物用DMSO 配制，最終檢測濃度為10、100 μmol/L，DMSO 體積分數均未超過0.2%。穩定表達ADRA1A 受體的CHO-K1 細胞以1.5×104個/孔接種到384 微孔板，過夜培養后加入20 μL 染料，再加入10 μL 配制好的樣品溶液后在培養箱中孵育1 h，再于室溫平衡15 min。檢測時，將細胞板、陽性激動劑板放入FLIPR 內指定位置，由儀器自動加入12.5 μL 的5×EC80濃度的陽性激動劑，運行抑制劑檢測程序，儀器總體檢測時間為120 s，在第21 秒時自動將12.5 μL 陽性激動劑加入到細胞板內。以1～20 s 的平均熒光強度值作為基線，21～120 s 的最大熒光強度值減去基線值即為相對熒光強度值（ΔRFU）。

激活率＝(ΔRFU化合物－ΔRFU背景)/(ΔRFUEC100激動劑－ΔRFU背景)

抑制率＝1－(ΔRFU化合物－ΔRFU背景)/(ΔRFUEC80激動劑－ΔRFU背景)

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 抑制滑膜炎癥相關靶點實驗結果

3.1.1 COX-2 實驗結果 通過多濃度梯度給藥，得到陽性抑制劑塞來昔布對COX-2 的抑制率曲線（圖1），計算得到IC50值為10.73 nmol/L。19 個化合物對COX-2 抑制活性實驗結果見圖2。由結果可知，與陰性對照組比較，丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B在10、100 μmol/L 對該酶抑制率達80%以上，均有顯著抑制活性（P＜0.001）；藁本內酯在10、100 μmol/L 對該酶也有較顯著抑制作用（P＜0.05、0.001），且都有一定濃度相關性。人參皂苷Rb1、阿魏酸在100 μmol/L 濃度對該酶抑制率均在70%以上，丹參酮IIA、黨參炔苷在100 μmol/L 濃度對該酶抑制率均在50%以上，均有顯著抑制活性（P＜0.001）；士的寧、茯苓酸、牛膝皂苷D 在10、100 μmol/L 對該酶抑制率在30%，且都具有顯著性差異（P＜0.01、0.001）。

圖1 陽性化合物活性曲線 (n = 2)Fig.1 Activity curves of positive compounds (n = 2)

圖2 19 個化合物對COX-2 抑制活性 (n = 2)Fig.2 Inhibitory activity of 19 compounds against COX-2 (n = 2)

3.1.2 NOS 實驗結果 通過多濃度梯度給藥，得到陽性抑制劑DPI 對NOS 的抑制率曲線（圖1），其IC50為22.68 nmol/L。19 個化合物對NOS 抑制活性結果見圖3。由結果可知，與陰性對照組比較，迷迭香酸、丹酚酸B 在10、100 μmol/L 對NOS 均有顯著抑制活性（P＜0.001），且100 μmol/L 濃度下抑制率達100%以上，抑制活性最強；人參皂苷Rb1、藁本內酯、馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷在10、100 μmol/L 均有顯著抑制活性（P＜0.05、0.01、0.001）；丹參素、蛻皮甾酮、甘草苷、茯苓酸、三七皂苷R1、白術內酯III 在100 μmol/L 濃度對該酶有顯著抑制作用（P＜0.01、0.001）。

圖3 19 個化合物對NOS 抑制活性 (n = 2)Fig.3 Inhibitory activity of 19 compounds against NOS (n = 2)

3.1.3 NF-κB 實驗結果 通過多濃度梯度給藥，得到陽性激動劑TNF-α 對NF-κB 的激動結果及細胞存活率（圖1），計算得到EC50為1.33 ng/mL，50%的細胞發生細胞毒性反應的濃度（median cytotoxic concentration，CC50）＞1000 ng/mL。19 個化合物對NF-κB 抑制活性及對細胞存活率影響見圖4、5。由結果可知，與陰性對照組比較，藁本內酯、茯苓酸、馬錢子堿在100 μmol/L 對TNF-α 誘導的NF-κB 均有顯著抑制活性，但結合細胞存活率結果，以上3個化合物在該濃度下的細胞存活率分別為67.5%、65.4%、87.0%，均顯示出顯著毒性（P＜0.05、0.001），因此推測藁本內酯、茯苓酸、馬錢子堿對NF-κB 抑制活性為假陽性結果；丹參素、阿魏酸低、高濃度及丹酚酸B、迷迭香酸、丹參酮IIA、甘草次酸高濃度和藁本內酯低濃度對NF-κB 均有顯著抑制活性（P＜0.05、0.01、0.001），且無細胞毒性。

圖4 19 個化合物對NF-κB 抑制活性 (n = 2)Fig.4 Inhibitory activity of 19 compounds against NF-κB (n = 2)

圖5 19 個化合物細胞存活率結果 (n = 2)Fig.5 Cell survival rate results of 19 compounds (n = 2)

3.1.4 CCR4 實驗結果 通過多濃度梯度給藥，得到陽性拮抗劑C-021 對CCR4 的拮抗結果（圖1），計算得到IC50為1.80 μmol/mL。19個化合物對CCR4拮抗活性見圖6。由結果可知，與陰性對照組比較，藁本內酯在低、高濃度對CCR4 均有顯著拮抗活性（P＜0.001），且呈濃度相關性；甘草次酸在高濃度對CCR4 有顯著拮抗活性（P＜0.001），其他化合物無顯著拮抗作用。

圖6 19 個化合物對CCR4 抑制活性 (n = 2)Fig.6 Inhibitory activity of 19 compounds against CCR4 (n = 2)

3.2 抑制血管翳形成實驗結果

通過多濃度梯度給藥，得到陽性抑制劑星形孢菌素對VEGFR2/KDR 的抑制率曲線（圖1），其IC50為8.40 nmol/L。19 個化合物對VEGFR2/KDR抑制活性結果見圖7。由結果可知，與陰性對照組比較，茯苓酸、牛膝皂苷D 在低、高濃度對該靶點有較強抑制作用（P＜0.01、0.001），抑制率最高分別為77.77%、60.51%；丹參素在高濃度抑制率為62.26%，有較好抑制作用（P＜0.001）；丹酚酸B、人參皂苷Rg1、馬錢子堿在低、高濃度有較弱抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001）；甘草次酸、三七皂苷R1、藁本內酯、迷迭香酸、甘草苷、阿魏酸在高濃度下對該酶均有較弱抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖7 19 個化合物對VEGFR2/KDR 抑制活性 (n = 2)Fig.7 Inhibitory activity of 19 compounds against VEGFR2/KDR (n = 2)

3.3 抑制基質降解相關靶點實驗結果

通過多濃度梯度給藥，得到陽性抑制劑NNGH對MMP-3 的抑制效應曲線，見圖1，其IC50值為18.14 mmol/L。19 個化合物對MMP-3 抑制活性實驗結果見圖8。結果表明，與陰性對照組比較，丹參素、藁本內酯、丹酚酸B、迷迭香酸在低、高濃度對MMP-3 表現出顯著抑制作用（P＜0.01、0.001），其中藁本內酯抑制率分別為70.84%、73.79%，丹參素高濃度抑制率為73.56%，均顯示較強抑制活性。黨參炔苷在高濃度亦有較弱抑制活性（P＜0.05），其他化合物無顯著抑制作用。

圖8 19 個化合物對MMP-3 抑制活性 (n = 2)Fig.8 Inhibitory activity of 19 compounds against MMP-3 (n = 2)

3.4 活血作用相關靶點實驗結果

3.4.1 凝血酶實驗結果 通過多濃度梯度給藥，得到陽性抑制劑阿加曲班對凝血酶的抑制率曲線（圖1），其IC50為602.30 nmol/L。19 個化合物對凝血酶抑制活性結果見圖9。由結果可知，與陰性對照組比較，丹酚酸B、迷迭香酸、阿魏酸、丹參酮IIA、丹參素在低、高濃度對凝血酶均有顯著的抑制活性（P＜0.01、0.001），且除丹參酮IIA外，其他4 個化合物都呈現濃度相關性。

圖9 19 個化合物對凝血酶抑制活性 (n = 2)Fig.9 Inhibitory activity of 19 compounds against thrombin (n = 2)

3.4.2 PDE3A 實驗結果 通過多濃度梯度給藥，得到陽性抑制劑曲喹辛對PDE3A 的抑制率曲線（圖1），其IC50為0.09 nmol/L。19 個化合物對PDE3A抑制活性結果見圖10。由結果可知，與陰性對照組比較，丹酚酸B、迷迭香酸在低、高濃度下對該酶均有顯著抑制作用，并呈濃度相關性（P＜0.001），且在高濃度下抑制率達100%以上，抑制活性強；丹參素、藁本內酯及甘草苷在高濃度時對PDE3A 抑制活性也較顯著（P＜0.001），其他化合物無顯著抑制作用。

圖10 19 個化合物對PDE3A 抑制活性 (n = 2)Fig.10 Inhibitory activity of 19 compounds against PDE3A (n = 2)

3.4.3 ADRA1A 實驗結果 通過多濃度梯度給藥，得到陽性拮抗劑WB4101 對ADRA1A 的拮抗曲線（圖1），其IC50為18.09 nmol/L。19 個化合物對ADRA1A 拮抗活性結果見圖11。由結果可知，與陰性對照組比較，馬錢子堿在低、高濃度對ADRA1A拮抗率分別為96.78%、74.54%，拮抗作用強（P＜0.001）且呈現濃度相關性；甘草次酸及藁本內酯高濃度和人參皂苷Rb1低濃度對ADRA1A 拮抗率分別為97.32%、64.09%、65.56%，也有較顯著拮抗活性（P＜0.001）。其他化合物無顯著拮抗作用。

圖11 19 個化合物對ADRA1A 抑制活性 (n = 2)Fig.11 Inhibitory activity of 19 compounds against ADRA1A (n = 2)

4 討論

RA 以持續性滑膜炎和血管生成為特征，導致滑膜增生及骨骼和軟骨的漸進性破壞[7]。成纖維樣滑膜細胞是除T 細胞和B 細胞外，RA 發生、發展的一個重要關鍵因素，在RA 炎癥反應和關節損傷方面起著非常重要的作用[8-10]。B 細胞活化產生的炎癥反應誘導劑淋巴毒素β（lymphotoxin β，LTβ），滑膜巨噬細胞釋放的TNF-α、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6 等細胞因子以及樹突細胞分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）促使Th17細胞分化的IL-17 共同刺激成纖維樣滑膜細胞過度增殖不斷產生大量炎性細胞因子，如IL-6、IL-1β、TNF-α 等，同時這些炎癥因子可以誘導或加速成纖維樣滑膜細胞轉化和遷移；產生的大量血管生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通過與其受體VEGFR2/KDR 結合，可促進血管形成，而不可控的新生血管形成可以導致炎細胞浸潤、滑膜組織增生，形成血管翳-軟骨結合和血管翳-骨結合，最終導致軟骨和骨破壞[11]；產生的MMP-3，可加重關節疼痛、腫脹、骨侵蝕和軟骨破壞等癥狀[12]。活化的成纖維樣滑膜細胞在炎癥因子如TNF-α、IL-6 和IL-17 的激發下，成纖維樣滑膜細胞表達NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）增多，同時大量的巨噬細胞集落刺激因子與前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）刺激成骨細胞中RANKL 表達升高，其與破骨細胞前體細胞表面的NF-κB 受體活化因子（receptor activator of NFκB，RANK）特異結合，通過激活下游NF-κB，促進與破骨分化相關基因抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）、MMP-1和MMP-3等表達，促使破骨細胞發生融合，細胞骨架重塑，促進骨吸收和骨質溶解，最終引起關節骨質侵蝕破壞[13-16]。本研究結果表明，痹祺膠囊中丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本內酯、人參皂苷Rb1、阿魏酸等主要成分能顯著抑制COX-2 活性，進而降低PGE2表達，抑制炎性及致痛反應；茯苓酸、牛膝皂苷D、丹參素、丹酚酸B、人參皂苷 Rg1、馬錢子堿等成分能顯著抑制VEGFR2/KDR 活性，從而減少新生血管形成；丹參素、藁本內酯、丹酚酸B、迷迭香酸能顯著抑制MMP3活性，減少基質降解，減緩軟骨破壞（圖12）。

NF-κB 作為核轉錄因子介導細胞存活、增殖、凋亡及免疫應答等多種生物過程，與RA 發病密切相關[17]。T 細胞、B 細胞表面上的抗體與對應受體結合，刺激三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）的形成，導致細胞內Ca2+濃度迅速升高[18-19]，激活下游活化T 細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）級聯信號反應的正調控[20]及NF-κB 信號通路，最終調節Th1、Th2、Th17 細胞分化并產生γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2、IL-12、IL-17 等細胞因子，同時使得活化后的B 細胞產生免疫球蛋白，進而在機體自身免疫反應及炎癥反應中共同發揮調節作用[21-23]。另外，CC 亞族趨化因子配體22（CC chemokine ligand 22，CCL22）通過靶向作用受體CCR4 激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K），進一步調節NF-κB 信號通路，最終作用于DNA 轉錄因子釋放趨化因子CXCL1、CXCL2、CCL7 等，在細胞遷移、凋亡及細胞存活等方面發揮作用[24]。研究表明，RA 患者關節液中NO水平升高，NO 是一種重要的致炎因子，由NOS 催化L-精氨酸生成，在滑膜炎癥部位介導許多不同的細胞功能，包括細胞因子產生、信號轉導、線粒體功能和細胞凋亡[25]（圖13）。本研究結果表明，痹祺膠囊中丹參素、阿魏酸、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參酮IIA、甘草次酸、藁本內酯對NF-κB 有顯著拮抗作用；藁本內酯、甘草次酸對CCR4 有顯著拮抗作用；迷迭香酸、丹酚酸B、人參皂苷Rb1、藁本內酯、馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷等成分對NOS 有顯著抑制活性。

RA 屬于中醫“痹證”范疇，歸屬于血瘀證。研究表明，血瘀證是RA 的基本病機之一[26]。凝血酶通過與其受體F2R 作用，激活磷酯酶Cβ（phospholipase Cβ，PLCβ），并特異性水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2）為IP3和DAG 2 個第二信使，從而激活Ca2+信號通路，隨著胞質內Ca2+濃度升高，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）被激活，通過磷酸化調節下游信號傳遞，最終引起血小板聚集[27]。另一方面，ADRA1A 被激動后，同樣可通過PLCβ 激活Ca2+信號通路，肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）可由鈣調蛋白2（calmodulin 2，CALM2）激活，進而對肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）進行磷酸化，使肌動球蛋白得以激活肌球蛋白ATP 酶，最終引起血管平滑肌的收縮[28]。此外，CALM2 可通過激動腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）產生cAMP，進一步活化蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），最終調節MLC，松弛血管平滑肌[29]（圖14）。本研究發現，丹酚酸B、迷迭香酸、阿魏酸、丹參酮IIA、丹參素能顯著抑制凝血酶活性；馬錢子堿、甘草次酸、丹參素、藁本內酯、人參皂苷Rb1能顯著拮抗ADRA1A；丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、藁本內酯、甘草苷能顯著抑制cAMP 降解酶PDE3A 活性，提高cAMP 含量。由此推測，痹祺膠囊通過干預凝血酶、PDE3A 及ADRA1A，進而抑制血小板聚集、促進血管平滑肌舒張，發揮活血作用。

圖14 痹祺膠囊活血作用機制Fig.14 Mechanism of Biqi Capsule in promoting blood circulation

綜上，COX-2、NOS、NF-κB、CCR4、VEGFR2、MMP3、凝血酶、PDE3A、ADRA1A 可能為痹祺膠囊治療RA 的部分作用靶點。其主要成分通過抑制COX-2、NOS、VEGFR2/KDR、MMP3 活性，拮抗NF-κB、CCR4，抑制滑膜炎性反應、滑膜異常增生、血管翳形成及關節軟骨破壞；通過抑制凝血酶及PDE3A 活性，拮抗ADRA1A，抑制血小板聚集、促進血管平滑肌舒張，發揮活血作用。由于實驗方法有限，本研究僅對RA 相關的幾個靶點進行實驗研究，后續還應聚焦更多關鍵靶點進行更全面深入的探索。另外，本研究采用的是體外酶活性測定方法，缺少了機體對成分的吸收、代謝等的影響，并且本研究是對單個化合物獨立效果的分析，未開展組分配伍的活性研究，故后續實驗還需針對以上幾點開展體內驗證及配伍研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突