卵胞漿內單精子注射技術的精子優選方法

范宇平，胡燁，滕曉明

輔助生殖技術發展至今，已成為解決人類生育問題的重要手段，其包含和衍生出的各種技術也隨著輔助生殖技術本身的進步而日新月異。現在卵胞漿內單精子注射技術（ICSI）日益成熟，對于男性而言配子的問題是最受關注的，也關乎輔助生殖的各個環節[1]。ICSI 中精子優選技術的應用對ICSI 結局的各個指標存在影響，如何合理選擇精子優選技術是各生殖中心如何提高胚胎質量的重要課題。

1 常規精子優選方法

常規精子優選是指采用人工方法去除精漿、死亡或在鏡下明確畸形的精子及其他有害物質，選擇活動力強，形態學相對更好的精子，并使精子在體外獲能。所謂常規，即在輔助生殖技術精液處理過程中會常規應用，主要包括了上游法和密度梯度離心（DGC）。

上游法是將精液和培養液共同孵育，使活動能力好的精子游到上層培養液中。該方法可除去精漿及精漿內抑制受精的物質，達到體外獲能。其優點在于操作簡便、成本低廉及不良反應少，并可獲得更高的顆粒大小和更低DNA 碎片率的精子[2]。但前向運動精子總數少、黏稠或不液化的精液使上游法回收率低，故不適宜通過上游法處理，因為精子必須克服重力和其他阻力向上游動。雖然上游法可回收質量較高的精子，但一般回收率相對較低[3]。上游法的回收率依賴于精子細胞團表面積和精子的活動力，受精液本身的質量和精漿中細胞碎片及白細胞的影響。

DGC 是將不同梯度的分離液和精液分層加入，經離心得到沉淀，然后定容于培養液中，通常該方法用于前向運動精子總數較少的精液。有研究認為，常規參數異常的精子經DGC處理后，得到優選精子的頂體反應率、低滲腫脹試驗陽性率和核成熟的精子比例均優于上游法[4]，經DNA 碎片率檢測發現，DGC 處理后的精子DNA 完整性明顯高于經上游法處理的精子[5]，因而建議選擇DGC 對質量較差的精子進行優選。DGC 的優點是處理精液后的精子回收率較高，處理時間較短，但對比上游法，DGC 成本略高，且離心操作可能對精子存在一定損傷，因而一般推薦用于前向運動精子明顯少的精液。

2 不動精子的優選

當ICSI 精液處理時發現，精液中全部或絕大多數是不活動精子，例如精子鞭毛多發形態異常（MMAF）或者纖毛不動綜合征這樣的極端情況，上游法無法實現精子優選，DGC 也不能確定獲得存活的精子。對于這樣的情況，應選擇更有效的精子優選方式以獲得活精子。

低滲透腫脹試驗是ICSI 前判斷精子是否存活的最古老也是最簡便的方法，由此判斷不動精子是否存活。由于過程簡單、成本低，低滲腫脹試驗的臨床應用十分廣泛，其有效性也可以明確，但低滲腫脹試驗處理后的精子ICSI 的操作時會比較困難，且低滲腫脹試驗后待精子恢復原樣再行ICSI 需要等待較長時間。

激光輔助不動精子優選的方法是在ICSI 之前高倍視野下選擇形態較好的不動精子，在靠近精子尾部尖端處用激光點射，活精子在激光刺激后精子尾部會立即出現卷曲或折角的現象。激光導致精子尾部卷曲的機制尚不清楚，可能與激光照射后介質流入精子尾部有關[6-7]。由于激光點射部位在精子尾部尖端，盡量遠離精子DNA 區域，因而推斷不會對精子DNA 造成損害。有研究認為此方法可以有效鑒別極重度弱精子的存活情況，這些存活的極重度弱精子通過ICSI 可以達到與正常精子基本相同的受精率，而且有助于提高卵裂率和優質胚胎率[7]。但也有研究顯示激光輔助不動精子優選后的ICSI 與傳統相比，雖然能夠提高受精率，但囊胚形成率、質量和利用率均有下降[8]。因為必要性和安全性的爭議，目前激光輔助精子優選在臨床開展相對較少。

3 精子形態的分選

形態選擇單精子注射（IMSI）是基于活精子細胞器形態學檢測的技術，其利用倒置顯微鏡結合數碼放大的原理，可將放大倍數提高到6 300 倍，甚至有報道其可放大倍數提高到13 000 倍[9]，從而可以觀察到精子的超微結構，并依據精子形態學快速檢查標準，對精子頂體、頂體后致密層、頸部、尾部、線粒體和精子核6 個部分進行形態學觀察，選擇符合正常形態標準的精子進行ICSI。但IMSI 的臨床價值尚存爭議[10-11]，首先IMSI 的形態學觀察具有一定主觀性，各文獻報道差異較大；其次，即便可以優選形態正常的精子，也并不能排除DNA損傷的精子，因此有的研究認為其對ICSI 的結局并沒有改善[12]。目前共識認為，對于圓頭精子癥等特殊類型的畸形精子癥，IMSI配合卵母細胞激活可以提高ICSI 成功率[13]。

評價精子質量還應考慮精子細胞質的異常。細胞質成熟的精子細胞核具有固有的雙折射，因而有了偏振光顯微鏡優選精子的方法。精子頭部的雙折射可以作為反映其細胞核正常結構組織的指標。雙折射也可以評估頂體反應的狀態，因為細胞質成熟的精子在整個頭部出現雙折射，而發生頂體反應的精子僅在頂體后區存在雙折射[14]。精子頭部的雙折射模式與精子活力和正常形態之間有一定的相關性，形態異常或活力差的精子具有異常雙折射模式，且形態與雙折射特性的關聯性更強[15]。偏振光顯微鏡精子優選是一種無創的物理優選手段，但其過程耗時長，目前臨床應用尚不多。

4 精子功能的優選

精子功能的優選方式中，由透明帶穿透試驗而來的透明質酸結合試驗臨床常見。該方法是在普通的Petri 皿上增加4 個固定的透明質酸點，并在該點的周圍滴加洗滌過的精子，經培養結合15 min 后，成熟的精子便會結合在透明質酸點上，而其他不成熟精子不會結合到該點而是自由游動。行ICSI 時只要選取結合在透明質酸點上的精子即可[16]。由于透明質酸是宮頸黏液和卵泡液的組分，因此透明質酸結合法能保證安全性。也有研究顯示，通過透明質酸結合試驗優選的精子，其正常形態率、核蛋白成熟度顯著增高，DNA碎片率顯著降低[17]，在嚴重畸形精子癥ICSI 中受精率和胚胎質量也有顯著提高[18]，是目前臨床相對開展較多的精子功能優選方法。

膜聯蛋白V選擇法是一種較為常用的磁珠活性細胞分選技術，即將膜聯蛋白V 偶聯在微小的磁珠上，將精子混懸液同磁珠混懸液孵育，凋亡的精子就會吸附在磁珠上，將此混合液通過具有磁性的分選柱，吸附凋亡精子的磁珠便會吸附在分選柱上，而未凋亡的精子則會自由通過。精子凋亡的標志包括線粒體跨膜電位破壞、caspase-3 激活、磷脂酰絲氨酸外翻及DNA 碎片率升高等。研究顯示，這些指標都是受精失敗的相關因素[19-20]。但由于膜聯蛋白Ⅴ選擇法無法篩選去除白細胞及未成熟的精子，故需與DGC 聯合使用。這一方法也可用于對冷凍后精子篩除凋亡精子的優選[21]。研究顯示，與傳統ICSI 相比，經膜聯蛋白V選擇法的患者受精胚胎質量、著床率、臨床妊娠和持續妊娠率等均無統計學意義，僅在年齡＜30 歲的分組中，膜聯蛋白Ⅴ選擇法的優質囊胚率、臨床妊娠率、持續妊娠率更高[22-23]，其臨床價值亦不確定。證據表明，電泳法對精子活力存在負面影響，且使用負電位的機制優選精子對精子總數要求相對較高，并存在出生性別比的爭議[22]。

綜上所述，從目前臨床數據看，基于形態學和精子功能的精子優選技術有理論上的價值，但對于ICSI 的臨床結局的改善沒有明確的證據。目前還有一些新的精子優選技術，如微流體分離以及使用芯片技術的方法，方法越來越多，且不斷在革新。因為沒有具有壟斷優勢的技術，臨床值得思考的是如何選擇合適的方法去解決實際問題。

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