骨老齡化引起骨折修復的研究進展

江磊，倪寧，陳劍明

隨著全球老齡化的進程，老年人骨質疏松癥發病率及引發的骨折也逐漸增加[1]，因骨質疏松而導致的骨折（如股骨骨折）臨床治療效果差，大多是采用人工關節置換[2]，并且醫療費用較高[3]。骨質疏松癥的患者還可以通過藥物治療（如合成代謝或者抗吸收），但是藥物全身效應及不良反應嚴重影響了治療效果[4]。骨折的愈合通過炎癥、修復及重塑的階段進行[5]。調節炎癥可以對損傷后的愈合有較大的幫助，而骨質疏松癥患者多出現隱匿性骨折，往往沒有明顯的感染而呈現低度慢性炎癥過程[6]。因此骨質疏松癥患者引起的骨折通過適當調節炎性反應，具有較好的治療效果[7]。

骨老齡化是骨再生不平衡的另一種特征，表現為骨形成減少并出現骨吸收增加，從而使骨折后骨愈合受損。大量數據表明，骨折的愈合驅動在于骨骼干細胞（SSC），SSC具有自我更新、促進骨關節炎及骨折愈合等能力。近期研究報道結果發現衰老能影響干細胞功能[8]。然而，長期以來，人們只能夠在培養基中培養和分離出一種被認為是SSC 的細胞群，這些細胞由多種類型的干細胞組成，并非最原始的SSC。后來，通過譜系追蹤和克隆等研究方法，科學家發現了支持小鼠SSC 存在的證據[9]。這為研究開辟了新的途徑，包括老齡化骨折后骨骼干細胞（SSC）激活的影響。

1 炎癥/老齡化

炎癥反應是骨骼損傷后啟動骨折愈合的首要過程。損傷后急性炎癥細胞如（中性粒細胞）會對骨折處血腫初步形成做出反應。急性炎癥反應中的巨噬細胞分泌的細胞因子和炎癥介質會繼發引起SSC及祖細胞對骨折部位進行修復[10-11]。除損傷部位產生急性炎癥外，炎癥的消退對骨折的愈合也至關重要。由于衰老組織的特征是持續性低度慢性炎癥狀態[12]，因此衰老引起的慢性炎癥可能對老年人骨折愈合的適當炎癥介質啟動有一定影響。最新研究表明，急性炎癥反應的適當啟動及短暫炎癥消退對于刺激骨折愈合是至關重要的[13]。急性炎癥期，典型的炎癥介質M1 型巨噬細胞被激活，炎癥消退包括巨噬細胞復極是激活炎癥介質M2 型巨噬細胞的表現，并與組織再生密切相關[14]。在老齡化中骨折引起的慢性炎癥會導致巨噬細胞從M1 型到M2 型復極失敗，使骨細胞活性增加，而成骨細胞形成減少[15]，導致故愈合障礙。此外在老齡化中，通過腫瘤壞死因子（TNF）- 等介質持續存在的無對抗性炎癥刺激，能促進破骨細胞生成和骨吸收[16]。

近期有研究顯示，小鼠模型支持衰老相關引起慢性炎癥損害骨骼再生的論證（封三彩圖3），利用熒光激活細胞分類（FACS）分析在年輕小鼠和老年小鼠股骨頸部外周血炎癥反應對比，發現老年小鼠組中損傷前基線水平在促進炎癥、經典的激活單核細胞百分比支持慢性炎癥狀態有顯著統計學意義[17]。針對損傷的反應，老年小鼠比年輕小鼠表現出更高比例的循環的、典型激活的單核細胞。相比之下，老年小鼠沒有表現出隨后非經典單核細胞的激活的增加。使用聚合酶鏈反應（PCR）對老年小鼠和年輕小鼠損傷后2 周的骨折骨痂組織進行基因表達分析，以評估衰老過程中骨折的不同轉錄反應。在年輕的骨折骨痂標本中，炎癥基因表達下調，而在老年小鼠的標本中，則保持上調，且老年小鼠幾種Toll樣受體（TLR）上調[18]。MyD88 是一種銜接蛋白，它介導TLR 信號分泌炎性細胞因子和招募免疫細胞。而MyD88 活性在老齡小鼠和老年人骨折患者中均增強。通過小分子抑制劑在小鼠骨折部位的膠原海綿上抑制MyD88 二聚和活化，通過增加新骨形成和骨痂形成促進骨折愈合。這些數據表明，分子療法對骨折部位炎癥反應的調節可能具有促進老年人骨折愈合的轉化潛力[19]。

免疫細胞和活化的干細胞之間的作用可對骨折部位的愈合具有極其重要的作用，而在衰老時這種相互之間的關系可能被中斷。在組織中，細胞因子環境促進細胞衰老是慢性炎癥的特征，稱之為衰老相關分泌表型（SASP）[20]。最新研究發現小鼠的骨骼中存在SASP，這是導致常駐干細胞衰老和功能受損的因素之一[21]。TNF- 、白介素（IL）-1 和活化B 細胞p65（Rela）的核因子- 輕鏈增強子是目前所知道的導致這種效應的細胞因子。NF-KappaB 是一種炎癥介質，它通過信號傳導促進炎癥細胞因子的分泌。該介質在衰老小鼠的細胞中顯示激活狀態，隨后實驗繼續表明小鼠骨骼干和祖細胞中NF-KappaB活性的病理激活導致細胞衰老和成骨干細胞分化受損[22]。相反，通過全身抗炎或使用選擇性小分子拮抗劑，通過藥物抑制NF-KappaB，可部分逆轉受損的成骨表型[23]。在骨折愈合過程中，干細胞也與巨噬細胞招募增加有關。

為了更好的利用干細胞調節炎癥反應的能力，已經開發了幾種基于細胞和小分子的策略。在存在炎癥刺激的情況下首先對干細胞進行預處理（“啟動/激活”）[24]。隨后，激活的干細胞促進急性炎癥反應的消退并開始愈合[25]。同樣，小分子策略也可以促進從急性炎癥反應到促進愈合的轉變。

2 SSC

SSC 被認定為：能夠自我更新；經歷向骨、軟骨和基質細胞群的多普系分化[10]；根據細胞表面標志物可前瞻性分離；排除脂肪等非骨骼化[25]。干細胞作為一種細胞治療手段，在再生受損骨骼組織中具有很好的前景，但是由于干細胞分離困難的局限性，導致利用干細胞對骨組織再生的想法尚未實現。圖1 顯示骨折的SSC在老齡化慢性炎癥對骨折的愈合的影響。在衰老的情況下M1 型巨噬細胞對SSC 的初始炎癥反應和信號傳導異常，包括NF-kappaB 信號傳導增加。促炎環境還表現為促進炎癥消解的細胞因子的生成減少，同時M1 型巨噬細胞對M2 型巨噬細胞的復極性受損。延長炎癥信號導致SSC 的成骨分化受損，SSC 衰老加劇（抗衰老信號減少，如SIRT1）。同時，延長炎癥信號傳導（如TNF- ）會導致破骨細胞活化和骨吸收增加。

通過使用細胞表面標志物差異的干細胞群體經過FACS 純化的方法，成功實現了小鼠骨骼干細胞（MSSC）和人類骨骼干細胞（HSSC）的區分，骨骼的骨、軟骨和基質細胞譜系是由自我更新的多能干細胞（SSCs）生成的。盡管不依賴于精確的干細胞分離方法會導致細胞群的可變性和異質性，但通過FACS純化，能夠前瞻性地分離SSC，并從干細胞的角度研究老齡化對骨折愈合的影響。

在小鼠發生骨折過程中，衰老會導致mSSC 功能受損。對老年小鼠與年輕小鼠骨折部位SSCs 的分析表明，它們的自我更新能力和骨軟骨生成分化能力均降低。此外，來自衰老小鼠SSC 的骨髓基質細胞對造血功能有負面影響。在老年小鼠中，觀察到與年輕小鼠相似的循環炎癥細胞現象，老齡化SSC 出現年輕小鼠類似功能缺陷，而衰老炎癥細胞同樣使年輕小鼠SSCs 產生功能性衰老[26]。這些數據表明，循環炎癥反應中與年齡相關的變化可以影響SSC 功能。

通過全轉錄組測序顯示，SSC存在不同的亞群，這些亞群基于富集的表達基因，這可能是對其他相關的啟動。在調查老齡化動物SSC 轉錄多樣性中發現多樣性明顯減少，且顯著偏離成骨潛能，而前基質轉錄活性增加[27]。此外，老齡化的mSSC 在造血譜系中明顯趨于破骨細胞發生，從而進一步提供衰老導致骨吸收的機制。在人類研究中，對年輕人和老年人的骨折中獲取hSSCs 進行比較[28]，發現年輕人與老年人SSC 有較大差異，而老年人和年輕人骨折來源的SSC 的克隆原性/干細胞自我更新特性無明顯差異，這與最近在小鼠身上進行的研究相反，該研究顯示SCC 隨著年齡增長減少[29]。一種假設是，老齡化SCC 的終末分化受損從而導致退出干細胞池，從而使得老年人干細胞減少。但是，相比年輕SSC，老年SSC 在成骨和成軟骨分化能力方面表現出明顯缺陷（封三彩圖4）。此外，使用微陣列進行的整體基因表達分析表明，老年人骨折導致SSC 中的成骨基因下調。轉錄組學分析還顯示，在老年SSC中，細胞衰老途徑上調，抗衰老因子下調，如組蛋白脫乙酰酶Sirtui1。有趣的是，激活Sirtuin 信號的小分子可以部分恢復老年性hSSC 的成骨分化表型。因此，在骨折修復過程中，老齡化不僅與干細胞性成骨缺陷有關，而且還表明細胞抗衰老信號減弱。這些研究表明，分子療法是失調的衰老細胞途徑中治療骨折疏松引起骨折愈合障礙的潛在靶點。

3 總結與展望

老齡化是引起骨折患者發病率增長的主要來源之一，其骨折愈合障礙風險也成比例增高，而炎癥反應和SSC 在細胞及分子水平上對骨折愈合產生了巨大影響。這些大量的研究結果表明在老齡化及骨質疏松背景下通過干預骨折愈合的治療策略上具有潛在的發展前景。

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