建蘭種子無菌萌發(fā)及根狀莖增殖分化研究

樊榮輝 葉秀仙 林榕燕 孔蘭 林兵 鐘淮欽

摘要：以建蘭雜交種子為外植體，通過探索果莢采收時間、植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA、NAA）等關(guān)鍵因子對建蘭種子萌發(fā)、根狀莖增殖與分化的影響，探討建蘭種子無菌萌發(fā)及根狀莖增殖與分化關(guān)鍵技術(shù)。結(jié)果表明：果莢最佳采收時期為花后8～10個月，種子萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基為 1/2MS + 花寶1號1.5 g·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1；根狀莖增殖的適宜培養(yǎng)基為 1/2MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，增殖系數(shù)達(dá)5.34；根狀莖分化的適宜培養(yǎng)基為1/2MS + 6-BA 2.0 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，分化率達(dá)56%。

關(guān)鍵詞：建蘭；無菌萌發(fā)；根狀莖；增殖；分化

中圖分類號：S682.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2095-5774（2023）01-0007-04

Study on Aseptic Germination of Seeds and Rhizomes? ?Proliferation and Differentiation

in Cymbidium ensifolium

Fan Ronghui，Ye Xiuxian，Lin Rongyan，Kong Lan，Lin Bing，Zhong Huaiqin*

（Institute of Crop Sciences，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Science / Fujian Engineering Research Center for Characteristic Floriculture，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China）

Abstract：Taking the hybrid seeds of Cymbidium ensifolium as explants，the key techniques of aseptic germination and rhizomes proliferation and differentiation were discussed by exploring the effects of key factors such as harvest time of capsule and plant growth regulators （6-BA and NAA） on seed germination，rhizome proliferation and differentiation in Cymbidium ensifolium. The results showed that the best harvest time of capsule was 8-10 months after flowering，and the suitable medium for aseptic seed germination was 1/2MS + Hyponex No.1 medium 1.5 g·L-1? + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1；the suitable proliferation medium for rhizomes was 1/2MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1? + AC 0.3 g·L-1，and the proliferation coefficient reached 5.34；the suitable differentiation medium for rhizomes was 1/2MS + 6-BA 2.0 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，and the differentiation rate was 56%.

Key words： Cymbidium ensifolium；Aseptic seeding；Rhizome；Proliferation；Differentiation

建蘭（Cymbidium ensifolium）又稱四季蘭，是蘭屬地生蘭的一種，也是國蘭最主要的種類之一，以主產(chǎn)地福建命名，是唯一以省份命名的國蘭［1］。建蘭株型飄逸、花香清幽、花期長，既能賞花又能觀葉，是福建省重要特色商品花卉。目前，建蘭市場需求量逐步上升，新品種不斷推陳出新，但產(chǎn)業(yè)規(guī)模和產(chǎn)品品質(zhì)還面臨著很大挑戰(zhàn)。利用我國豐富的建蘭種質(zhì)資源，開展廣泛雜交育種，是培育優(yōu)異建蘭新品種的重要手段。雜交種子的無菌萌發(fā)和根狀莖增殖是快速獲取新品種植株的重要途徑。本研究通過篩選建蘭果莢采收時間，種子無菌萌發(fā)、根狀莖增殖與分化的最適培養(yǎng)基，以期為新品種選育提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1試驗材料

建蘭種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究中心溫室大棚。以建蘭‘君荷與‘怡紅雙嬌雜交獲得的果莢為試驗材料，果莢中的種子作為外植體進(jìn)行無菌萌發(fā)。

1.2 消毒處理

先將果莢置于洗滌劑中浸泡10 min，流水沖洗30 min，無菌水沖洗2遍，再用75%的酒精進(jìn)行表面消毒30 s，之后置于0.1％升汞溶液中浸泡消毒10 min，期間輕輕搖晃，消毒結(jié)束后，用無菌水沖洗５次。

1.3不同采收時期的種子萌發(fā)

分別于人工授粉后6個月、8個月、9個月和10個月進(jìn)行采收。果莢選取標(biāo)準(zhǔn)為綠色尚未開裂，飽滿健康。將消毒后的果莢放入無菌接種盤，無菌紙吸干表面，切開果莢，將種子均勻地撒播在培養(yǎng)基上，每個處理10瓶，黑暗條件下培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基為1/2MS，附加NAA 0.2 mg·L-1 + 6-BA 2.0 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1 + 瓊脂5 g·L-1 + 活性炭（AC） 0.3 g·L-1，180 d和240 d后統(tǒng)計種子萌發(fā)情況。

1.4 種子的無菌萌發(fā)培養(yǎng)

以授粉后9個月的果莢取出種子為材料，基本培養(yǎng)基為1/2MS，以不添加生長調(diào)節(jié)劑為空白對照，另外添加花寶1號 1.5 g·L-1，或花寶1號?1.5 g·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1 +NAA0.2 mg·L-1，并附加AC 0.3 g·L-1 + 蔗糖30 g·L-1 + 瓊脂5.0 g·L-1，pH值5.8，進(jìn)行種子無菌萌發(fā)，每個配方接種10瓶，240 d后統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)，觀察根狀莖生長情況。

1.5 根狀莖的增殖與分化培養(yǎng)

選擇生長狀態(tài)相近的根狀莖，無菌條件下切成0.5～0.8 cm的切段，接種于培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接種10個根狀莖，每個配方接種5瓶?；九囵B(yǎng)基為 1/2MS，植物生長調(diào)節(jié)劑選用 NAA 和 6-BA，NAA濃度為 0.3、1 mg·L-1，6-BA濃度為0.5、1、2 mg·L-1，均附加蔗糖 30 g·L-1 + 瓊脂 5 g·L-1+ AC 0.3 g·L-1 。60 d后觀察根狀莖增殖與分化情況，計算增殖系數(shù)和芽分化率，增殖系數(shù)=新長出的根狀莖數(shù)／接種的根狀莖數(shù)，芽分化率（%）=（分化出芽體的根狀莖數(shù)／接種的根狀莖數(shù)）×100%。

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用 Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果莢采收期對種子萌發(fā)的影響

果莢采收期對種子萌發(fā)的影響如表1所示，花后6個月采收時，種子經(jīng)暗培養(yǎng)180 d均未產(chǎn)生根狀莖，240 d時產(chǎn)生少量根狀莖；花后8個月采收時，種子經(jīng)暗培養(yǎng)180 d和240 d時產(chǎn)生的根狀莖數(shù)量均有增多；花后9個月時（即種子進(jìn)入成熟期），萌發(fā)的根狀莖數(shù)量最多；花后10個月時，種子的萌發(fā)數(shù)量略有下降。以上結(jié)果表明花后8～10個月的種子適宜作為外植體。

2.2 不同培養(yǎng)基對建蘭種子萌發(fā)的影響

建蘭種子在培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)180 d后陸續(xù)有綠色芽點出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)育成根狀莖。種子在不同培養(yǎng)基中的萌發(fā)效率如表2顯示，培養(yǎng)基組分影響了建蘭種子的萌發(fā)效果，種子在無生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中的萌發(fā)效果最差，在添加花寶1號的培養(yǎng)基中的萌發(fā)效果有所提高，添加植物生長調(diào)節(jié)劑后，即在1/2MS +花寶1號1.5 g·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1培養(yǎng)基中的萌發(fā)效果最好。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對根狀莖增殖與分化的影響

將種子無菌萌發(fā)獲得的根狀莖作為材料，研究植物生長調(diào)節(jié)劑NAA和6-BA對根狀莖增殖和分化的影響。結(jié)果如表3所示，NAA和6-BA濃度配比不同，根狀莖增殖和分化差異較明顯。在一定范圍內(nèi)，較高濃度NAA和較低濃度6-BA更有利于根狀莖增殖，較適培養(yǎng)基為1/2MS + NAA 1 mg·L-1+ 6-BA 0.5 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，增殖系數(shù)達(dá)到5.34；較低濃度NAA和較高濃度6-BA更有利于根狀莖分化，最適培養(yǎng)基為1/2MS + NAA 0.3 mg·L-1+ 6-BA 2 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，芽分化率達(dá)到56%。

3討論

建蘭種子數(shù)量雖多，但因種胚發(fā)育不完全，無胚乳，其種皮中又含有抑制萌發(fā)的物質(zhì)，導(dǎo)致自然條件下很難萌發(fā)，一般采用無菌培養(yǎng)的方式促其萌發(fā)。研究表明，接近成熟的果莢有最高萌發(fā)率［2］。本研究通過果莢采收期對種子萌發(fā)影響的研究表明，種胚發(fā)育不完全不利于種子萌發(fā)，隨著種胚發(fā)育完全，種子萌發(fā)速度增快，萌發(fā)率逐漸提高，但采集時間較晚的種子，萌發(fā)率又會下降，可能與內(nèi)部形成抑制萌發(fā)的物質(zhì)有關(guān)［3］，可初步得出種子萌發(fā)率在一定范圍內(nèi)，隨種胚成熟度的提高而提高［4］，果莢采收期以8～10個月為宜。采收的種子，以切開果莢輕輕搖動有白色粉末掉落為宜。

植物生長調(diào)節(jié)劑在蘭花組織培養(yǎng)中對根狀莖增殖和分化起到非常重要的作用。NAA與6-BA不同濃度配比對根狀莖增殖影響也有較大差異，較高濃度NAA更適宜根狀莖增殖，其中 NAA?1 mg·L-1+ 6-BA 0.5 mg·L-1為根狀莖增殖最適培養(yǎng)基。前人研究結(jié)果表明在蘭屬植物中，較高濃度的6-BA和較低濃度的NAA有利于根狀莖分化成苗［5-7］，本試驗研究發(fā)現(xiàn)，NAA 0.3 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1更適宜根狀莖分化，分化率達(dá)56%。

參考文獻(xiàn)：

［1］劉清涌．中國蘭花名品珍品鑒賞圖典［M］. 福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，2004.

［2］楊應(yīng)華，吳小美. 蘭花種子萌發(fā)研究［J］. 熱帶作物科技，1994（3）： 32-34.

［3］黃家林，胡虹．黃花巧蘭種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)研究［J］. 云南植物研究，2001，23（1）：105-108.

［4］陳春滿，葉一枝，凌緒柏. 象牙白花蘭種子及莖尖培養(yǎng)與原球莖形態(tài)發(fā)生［J］. 園藝學(xué)報，2002，29（3）： 251-254.

［5］傅雪琳，張志勝，何平，等. 墨蘭根狀莖綠芽分化的研究機(jī)［J］. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，21（3）：53-55.

［6］朱根發(fā)，葉秀斌，陳明莉，等. 培養(yǎng)基不同成分對墨蘭根狀莖分化成苗的影響［J］. 中南林學(xué)院學(xué)報，2003，23（5）：42-44．

［7］王熊，張菊野，連宏坤，等. 素心建蘭無性繁殖系的建立及其開花［J］. 園藝學(xué)報，1988，15（3）：205-208.

（責(zé)任編輯：馮新）