有機小分子過氧化氫熒光探針研究進展及發展方向與應用前景

張燕軍，李潔麗 綜述 張 凱 審校

西南醫科大學：1.基礎醫學院 化學教研室；2.藥學院(瀘州 646000)

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一類高活性的含氧物質，在細胞的增殖、生長、免疫、信號傳遞等過程發揮著重要的作用[1]。過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）是人體內ROS 的重要組成部分，它主要來源于細胞線粒體，經線粒體傳遞鏈（electron transport chain，ETC）復合體等途徑產生[2-3]。H2O2對細胞具有雙重的生理作用：適量的H2O2有利于細胞的生長、分化和維持[4-5]；而過量的H2O2會引起細胞的損傷、凋亡和自噬，從而誘發炎癥、心腦血管疾病、老年癡呆（senile dementia，SD）和癌癥等多種疾病[6-8]。因此，精確識別和檢測細胞內H2O2對生命科學研究和臨床診斷都具有非常重要的意義。

針對H2O2常見的檢測方法主要有：比色法[9]、電化學法[10]、質譜分析法[11]和熒光分析法[12]等。其中，基于小分子熒光探針的熒光分析法由于具有操作簡單、生物相容度高、靈敏度高、選擇性強、可實時原位檢測等特點而備受關注；將熒光分析法與激光共聚焦顯微鏡技術結合而產生的熒光成像技術，也成為生物分析、檢測的重要手段，應用于生物學研究、疾病早期診斷和臨床治療評價等領域[13-14]。近年來針對H2O2熒光檢測和成像的研究已成為有機小分子探針發展的重要方向，本文將從小分子熒光探針的響應機理進行歸納總結，介紹H2O2熒光探針的設計、構建及生物應用，并展望其發展方向和應用前景。

1 H2O2熒光探針類型

H2O2熒光探針主要包括納米熒光探針及有機小分子熒光探針。小分子熒光探針由于具有純化簡便、結構明確、便于調控等優點，是熒光探針發展的重要方向。通常，小分子H2O2熒光探針依靠探針分子的識別位點與H2O2反應，發生結構變化，放出相應的熒光信號，從而實現對H2O2的熒光檢測。熒光探針對H2O2的響應大多是通過氧化反應實現的，主要反應類型有：硼酸酯的氧化、氧鎓離子的氧化、α-二羰基化合物的氧化、Payne/Dakin串聯反應和芳基磺酸酯的過氧水解等。

1.1 硼酸酯氧化型H2O2熒光探針

在溫和的條件下，硼酸酯可以與H2O2發生反應。基于這一特性，有大量的H2O2熒光探針被設計合成出來并應用于體內/外H2O2的熒光檢測與成像。LIN 小組[15]以咔唑為基本熒光母核，合成了具有長波長發射性能的咔唑乙烯基吡啶鹽，并以硼酸酯作為識別基團，構建了H2O2熒光探針CAI（圖1）。相較于咔唑，CAI具有更長的發生波長（575 nm），更長的Stocks 位移（157 nm），可有效避免熒光自吸收現象，提高探針的靈敏度。CAI 在H2O2的作用下，硼酸酯水解，釋放出酚羥基，導致熒光信號發生變化；由于吡啶鹽帶有正電荷，結合線粒體的質子泵作用，該探針分子還能靶向進入到細胞線粒體內[16]，實現細胞線粒體內H2O2的熒光檢測。但是由于該探針屬于關型，很容易受到背景干擾，這就限制了CAI在H2O2檢測方面的應用。

圖1 H2O2熒光探針CAI的結構和響應機理Figure 1 The structure of CAI and its response mechanism to H2O2

由于4-（二氰基亞甲基）-2-甲基-6-（4-二甲基氨基苯乙烯）-4H-吡喃（[2-[2-[4-（Dimethylamino）phenyl]ethenyl] -6-methyl-4H-pyran-4-ylidene]propanedinitrile，DCM）類染料發射波長長、光穩定性好，被廣泛應用于熒光探針的設計和構建中[17-21]。GAO等[22]以近紅外熒光染料DCM作為熒光母體，芐基作為可自脫落連接臂，硼酸酯作為識別基團構建了基于分子內電荷轉移（intramolecular charge transfer，ICT）增強的近紅外熒光探針DCM-HNU（圖2），用于H2O2的熒光檢測和成像。DCM-HNU 的發射在近紅外區域（658 nm），可有效降低光生物熒光和光散射帶來的背景干擾，且具有光毒性小、穿透性好的特點；Stocks 位移達205 nm，進一步避免了熒光自吸收現象，更有利于生物熒光檢測。進一步的溶液實驗證明，在pH=7.4 的緩沖體系中，DCM-HNU 對H2O2的響應具有非常好的選擇性和穩定性；在0～200 μM 濃度的緩沖溶液（pH=7.4）中，DCM-HNU 對H2O2的響應表現出優良線性關系，檢測限達到了0.17 μM。在此基礎上，研究者將DCM-HNU應用于Hela 細胞及斑馬魚體內H2O2的熒光檢測和成像，結果表明，DCM-HNU對內源性和外源性的H2O2都具有非常好的響應。

圖2 近紅外熒光探針DCM-HNU的結構和響應機理Figure 2 The structure of DCM-HNU and its response mechanism to H2O2

由于雙光子熒光成像具有激發波長長、穿透性好、生物毒性小、空間分辨率高、可實時暗場成像等優點，已成為生物熒光成像的重要研究領域[23-25]。LI 等[26]以DCM 作為熒光單元，硼酯作為識別基團，構建針對H2O2的近紅外熒光探針TPNR-H2O2（圖3），進行生物體內H2O2的雙光子熒光成像。通過雙光子激發、TPNR-H2O2與H2O2反應后，可在近紅外激發（860 nm）、近紅外發射（573～ 630 nm），有效避免了生物熒光干擾。溶液中的熒光檢測表明，TPNR-H2O2對H2O2的檢測限達72.48 nm，可以用來檢測低濃度的H2O2。MTT 實驗證實探針具有較低的生物毒性后，作者將TPNR-H2O2與細胞內源性H2O2的雙光子熒光成像，并通過長時間激光激發的方式考察探針的光穩定性，TPNR-H2O2在實驗中表現出非常好的光穩定性，可用于細胞內H2O2的長時間動態監測。

圖3 近紅外熒光探針TPNR-H2O2的結構和響應機理Figure 3 The structure of TPNR-H2O2 and its response mechanism to H2O2

由于H2O2在腫瘤的產生和發展過程起著非常重要的作用，因此，發展具有腫瘤組織靶向能力的熒光探針鑒別腫瘤組織，對癌癥的早期診斷具有重大意義[27-28]。ZHU 小組[29]以萘酰亞胺作為熒光基團，硼酸作為識別基團，褪黑素作為腫瘤靶向基團構建H2O2熒光探針NH-MT（圖4）。實驗證明，NH-MT 具有較好的水溶性，在pH=7.4的緩沖溶液中可與H2O2發生反應，進而在550 nm釋放出強的熒光信號。作者進行了MTT（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide）實驗，證實探針具有較低的生物毒性；進一步的生物熒光成像實驗表明，NH-MT不僅可以實現細胞及斑馬魚體內H2O2的熒光成像，還能有效識別腫瘤細胞和正常細胞，為腫瘤的早期診斷提供成像依據。

圖4 H2O2熒光探針NH-MT的結構和響應機理Figure 4 The structure of NH-MT and its response mechanism to H2O2

LI 課題組[30]設計構建了喹啉鹽-氧雜蒽型的近紅外熒光染料QX-OH（圖5），該染料的發射波長達772 nm。又以QX-OH 為熒光基團，構建熒光探針QX-B。在生理條件下，隨著H2O2的加入，QX-B 被H2O2氧化，脫去硼酯和亞甲基酚，形成酚的結構，使ICT 增強，進而引起光信號的變化：溶液在585 nm 處的吸收明顯降低，又在725 nm 形成一個新的吸收峰，同時在772 nm處的發射也隨之增強。H2O2滴定實驗證明，在0.5～50 μM 濃度范圍內，探針在772 nm 處的熒光強度與H2O2的濃度呈現良好的線性關系，檢測限為0.17 μM，具有定量檢測H2O2的潛力。進一步的干擾實驗證明生物體系內常見的干擾離子、氨基酸和活性氧均不會與QX-B發生反應，證明QX-B 具有良好的選擇性。作者還采用核磁滴定和理論計算的方法，研究證實了QX-B 對H2O2響應的ICT 增強機制。MTT 實驗證明QX-B 具有較低的細胞毒性，進一步細胞成像實驗表明，QX-B 可以檢測內源性和外源性的H2O2，其成像熒光強度與細胞內的H2O2濃度相關。最后，QX-B 還被用于斑馬魚和糖尿病小鼠模型的熒光成像。斑馬魚實驗證明，QX-B 可以對生物體內的H2O2進行熒光監測。糖尿病小鼠實驗表明，小鼠體內H2O2表達水平與糖尿病的發生、發展密切相關，在糖尿病引發的氧化應激過程中，H2O2主要富集在肝臟和腎臟，且對腎臟的損傷明顯，這就為進一步探究熒光探針在糖尿病早期診斷和預防中的應用提供了可能性。

圖5 近紅外熒光探針QX-B的響應機理和成像研究Figure 5 The structure and response mechanism of QX-B to H2O2

線粒體是細胞產生活性氧的主要場所，也是次氯酸、ATP等生物活性物質的產生場所，這些活性物質在細胞微環境下共同作用，參與線粒體的各項生理活動[31-34]。因此，開發能夠同時檢測線粒體內多種活性物質及微環境狀態的熒光探針對研究線粒體生理功能和相關的生物化學過程具有實際意義[35-37]。TIAN課題組[38]以羅丹明和萘酰亞胺為熒光母體，構建熒光探針TFP（圖6），可通過雙光道熒光成像同時檢測線粒體內H2O2和ATP 的表達水平。萘亞酰胺一側為H2O2響應單元，當向探針溶液中加入H2O2時，硼酸酯發生水解，紫外吸收從410 nm 藍移至380 nm，且吸光度急劇降低；而雙光子吸收截面（λex=710 nm）則從（7±2）GM升高到（35 ± 5）GM，導致470 nm 的熒光強度顯著升高，同時伴隨熒光壽命的提高，反應在8 min 后達到平衡；H2O2滴定實驗表明，在0.4～10 μM 范圍內，470 nm的熒光強度與過氧化氫呈現良好的線性關系，檢測限在（68 ± 5）nM。羅丹明一側為ATP 響應單元，ATP 可與分子中的乙二胺單元通過氫鍵相互作用，打開螺環，形成開環的氧雜蒽結構，釋放出熒光信號。向TFP 溶液中加入ATP 后，在562 nm 出現一組新的吸收峰，而401 nm的吸收幾乎不變，證實了螺環的打開；用710 nm激發光進行雙光子熒光檢測，發現氧雜蒽的雙光子吸收截面增加至（125±12）GM，是螺環結構的50 倍，同時在590 nm出現一組強的熒光信號，并在2 min后達到平衡；滴定熒光實驗表明，ATP 與TFP 的結合常數為（173±8）M-1，TFP對ATP（0.5～15 mM）的響應呈現良好的線性關系，檢測限（33±2）μM；繼續向溶液中加入三磷酸腺苷雙磷酸酶，隨著溶液中ATP的消耗，590 nm的熒光消失，證明探針對ATP的檢測具有可逆性，這對實時生物檢測具有非常重要的意義。進一步通過溶液實驗證明了，TFP可同時選擇性地檢測H2O2和ATP，且沒有任何能量共振轉移（frster resonance energy transfer，FRET）和信號干擾的現象。最后，作者通過雙光子熒光壽命成像的方法，對神經元細胞線粒體內的氧化應激過程進行研究，探討了熒光探針在生化研究中應用的可行性。

同時實現對疾病的診斷和治療，也是當前熒光探針研究的熱點領域[39-42]。研究表明II 型糖尿病與肝腎疾病密切相關，相互促進，嚴重影響患者的身體健康，細胞內活性氧在中間起到了重要的作用[43-44]。YU等[45]以近紅外熒光基團DX作為診斷基團，硼酯作為響應、給藥基團，結合鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2（sodiumdependent glucose transporters 2，SGLT-2）抑制劑達格列凈設計構建了診療型熒光探針DX-B-DA（圖7），用于II 型糖尿病及其引發的肝、腎損傷的診斷和治療。DX-B-DA 與H2O2反應后，中間的硼酯部分脫落，同時釋放出熒光基團和藥物分子。溶液實驗表明，向DXB-DA 溶液加入H2O2后，溶液的最大吸收波長由590 nm紅移至685 nm，700 nm處的熒光也隨之增強。在熒光滴定實驗中，DX-B-DA 對H2O2的檢測響應下限為0.36 μM，并且對細胞內的其他活性氧、氨基酸、金屬離子均無明顯響應，表現出良好的選擇性。所以作者認為DX-B-DA 具有檢測生物體內H2O2的潛力。為了驗證DX-B-DA的診療能力，他們又以II型糖尿病小鼠模型進行進一步的生物治療、成像實驗。結果顯示，診療分子在檢測H2O2的同時，還能釋放出藥物分子，減輕糖尿病引發的肝腎損傷。

圖6 熒光探針TFP的結構及響應機理Figure 6 The structure of TFP and its response mechanism to H2O2

圖7 診療型熒光探針DX-B-DA的響應釋放機理Figure 7 The structure of DX-B-DA and its response mechanism to H2O2

1.2 氧鎓離子氧化型H2O2熒光探針

一般開關型的熒光探針，只有一個發射波長；比率型熒光探針在同一激發波長下可發出兩組不同波長的發射光，互為參照，可以根據兩組發射光的強度之比實現對目標物質的準確檢測[46-48]。LI 課題組[49]合成了一個具有氧鎓離子結構的比率型熒光探針GPC（圖8）。由于具有較長的共軛體系和推拉電子結構，GPC 本身在410 nm 和650 nm 有兩組較強的吸收；與H2O2反應后，由于共軛結構變短，410 nm 的吸收增強，650 nm 的吸收減弱，該變化通過肉眼也可以觀察到。同時在以410 nm 激光作為激發光源進行的溶液熒光實驗中，482 nm的熒光增強，706 nm熒光減弱。根據H2O2滴定實驗，706 nm 與482 nm 處的熒光強度之比（F482/F706）與溶液中過氧化氫的濃度（1～50 μM）呈現良好的線性關系（R2=0.9981），檢測限為0.33 μM。因為GPC對細胞內的其他活性物質幾乎沒有響應，所以具有對細胞內H2O2進行比率型熒光檢測的潛力。在生物成像實驗中，作者考察了探針的靶向能力，實驗證明，由于糖苷的引入，GPC可以選擇性地富集到肝細胞內，表現出非常強的熒光信號，而其他細胞則沒有這種現象；在使用Mito-Tracker Green 進行細胞器共定位的實驗中，由于氧鎓離子自身帶正電，GPC更多的富集到線粒體內，Pearson系數達0.91。最后作者還將GPC用于斑馬魚模型，為藥物的肝毒性研究提供成像依據。

圖8 比率型H2O2熒光探針GPC的響應機理Figure 8 The structure of GPC and its response mechanism to H2O2

1.3 α-二羰基化合物氧化型H2O2熒光探針

HE 等[50]以DCM 為染料，α-二羰基化合物為識別基團構建由關到開型的近紅外H2O2熒光探針DCHP（圖9）。DCHP 與H2O2反應后，酰胺堿斷裂，識別基團以對硝基苯甲酸的形式脫落，同時暴露出氨基，使分子的光學信號發生改變：溶液顏色由黃色變為紅色；紫外吸收峰從448 nm 紅移至487 nm；653 nm 的熒光信號（λex=487 nm）也增強22 倍。探針對H2O2具有良好的選擇性，檢測限為5.3 μM。作者在細胞水平驗證探針的實用性后，還以銅離子誘發驗證的斑馬魚作為模型，考察了探針對活體內H2O2的成像能力。

圖9 近紅外H2O2熒光探針DCHP的響應機理Figure 9 The structure of DCHP and its response mechanism to H2O2

1.4 Payne/Dakin串聯反應型H2O2熒光探針

YE等[51]以對亞甲基鄰羥基苯甲醛作為識別基團，萘亞酰胺和試鹵靈作為熒光信號基團，分別設計構建了基于Payne/Dakin 串聯反應的比率型熒光探針HKPerox-Ratio 和近紅外熒光探針HKPerox-Red（圖10），對H2O2具有很好的選擇性。HKPerox-Red被用來研究斑馬魚活體內的氧化應激現象，對H2O2表現出良好的響應性能，又被用來檢測含有葡萄糖、尿酸和肌氨酸等與糖尿病、痛風、前列腺癌相關物質的生物樣本。HKPerox-Ratio被用于白血病細胞內H2O2的熒光檢測，首次通過流式細胞儀和活細胞校正曲線實現了活細胞內源性H2O2的準確定量分析。作者期望探針可用于H2O2生理、生化作用方面的研究，并為藥物篩選和疾病診斷提供依據。

1.5 磺酸酯型H2O2熒光探針

圖10 H2O2熒光探針HKPerox-Ratio和HKPerox-Red的響應機理Figure 10 The response mechanism of HKPerox-Ratio and HKPerox-Red to H2O2

GUO等[52]開發了一種基于磺酸酯水解反應的近紅外熒光探針Cy-PFS（圖11）。苯并花菁作為熒光基團，具有近紅外發射、生物相容度高、生物毒性低、吸光系數大等特點[53-54]；因為響應機制為五氟甲磺酸的H2O2水解反應，可以有效避免生物環境中其他活性氧化物的干擾，提高探針的選擇性；苯環上的五個氟原子可以增強磺酸酯的H2O2水解活性，促進探針的靈敏度。由于推拉電子的長共軛結構，Cy-PFS 的最大吸收峰達830 nm，加入H2O2后，長共軛結構被酮式結構Keto-CY取代，在560 nm 出現一個新的吸收峰；在730 nm 光源激發下，Cy-PFS的發射峰位于836 nm，加入H2O2后，使用560 nm光源激發，635 nm處的發射隨之增強；因此，可以通過635 nm和836 nm兩處不同的發射波長，構建比率型熒光探針，對H2O2進行近紅外熒光成像。H2O2滴定實驗表明，0～100 μM 內，lg（F635/F836）與H2O2的濃度呈線性關系（R2=0.9880），檢測限50 nM。根據化學動力學實驗，10 μM 的Cy-PFS 與100 μM 的H2O2可在200 s內完成反應，反應的準一級速率常數為6.9×10-3S-1。外加其他活性氧化物、氨基酸、金屬離子等，對檢測不產生干擾，證明探針具有非常好的選擇性。在此基礎上，使用激光共聚焦熒光成像，可以對細胞內H2O2進行監測，進而研究與之相關的能量代謝和細胞增殖過程。最后，Cy-PFS被用來檢測不同發育階段小鼠大腦內H2O2的表達水平，研究了內源性H2O2與小鼠大腦發育及細胞有絲分裂密切相關，首次闡明了內源性H2O2可以作為信號分子促進細胞的有絲分裂，加速大腦的發育。

圖11 比率型熒光探針Cys-PFS的結構及響應機制Figure 11 The structure of Cys-PFS and its response mechanism to H2O2

2 小結與展望

熒光檢測技術是當前針對生物活性物質的重要研究手段，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、可實時原位分析等優點。熒光成像技術將熒光探針與激光共聚焦顯微鏡技術結合，可對細胞、組織和活體內的活性物質進行實時原位成像分析，是當前生命科學、醫學和化學領域研究的前沿科學技術。

本文主要綜述了近五年H2O2熒光探針的研究進展，在響應機理的基礎上，歸納總結了部分H2O2熒光探針的設計策略、發展方向及其在生物學研究中的應用，表明熒光探針在生物以及臨床診斷、治療領域中發揮著極其重要的作用。但是，當前報道的H2O2熒光探針發射波長大多集中在可見光及近紅外一區，導致其組織穿透性和空間分辨率不足，限制了熒光探針在生物活體成像領域的應用。由于近紅外二區的熒光探針激發波長更長、穿透性更強、光毒性更小、背景干擾更低等特點，開發新型近紅外二區熒光染料，并將其作為熒光基團構建近紅外二區的熒光探針是今后H2O2熒光探針發展的重要方向。此外，因為單一熒光成像仍然很難滿足目前對深層、活體、超靈敏、三維、高時空分辨率等檢測的需求，因此，結合核磁、光聲等成像手段構建針對活體內H2O2檢測的多模態生物檢測平臺，也是未來熒光探針發展的重要內容。