積雪草苷多功能型水凝膠支架制備及對細胞黏附和三維培養的應用價值

王田田，賀 鋼，何 茹，文譽龍，嚴 晨，胡佳欣，楊朝鮮

西南醫科大學基礎醫學院（瀘州 646000）

水凝膠是高度水溶脹的分子網絡，具有良好的生物相容性和可降解性，是創建組織模擬物的理想平臺。此外，生物相容性良好的特性能把引起組織炎癥反應的可能性降到最低[1]。到目前為止，已有海藻酸鈉作為支架材料進入臨床試驗，在創傷修復方面已取得較大進展[2-4]。但傳統制得的海藻酸鈉水凝膠缺乏強度，容易發生永久性斷裂，而且它們內部的結構簡單，缺乏特殊的功能，這很大程度上導致海藻酸鈉在組織工程中的應用停留在細胞及動物實驗階段[5-7]。

為滿足臨床實際需求，開發生物相容性良好、無副作用的功能型水凝膠是本領域需求的重點[8-11]。研究發現，海藻酸鈉能和光敏感基團發生交聯凝膠化，形成強粘附多功能混合水凝膠[12]。而對于海藻酸鈉水凝膠強度較低的問題，中藥單體可以提高水凝膠的物理特性，獲得多功能型水凝膠[13-16]。在這一凝膠體系中，中藥單體既是藥效分子，又能充當遞送載體，表現出良好的自緩釋性和生物相容性[17]。

積雪草苷是從傘形科積雪草的全草中提取出來的中藥單體。積雪草苷的研究揭示這種中藥單體除了治愈皮膚損傷，在傷口愈合過程中還起到修復因炎癥堆積引起的皮膚老化和增強皮膚彈性的作用[18]。此類天然藥物小分子不需要任何修飾，通過交聯劑和海藻酸鈉形成水凝膠，提高其機械特性的同時，對傳統支架材料的生物相容性也有促進作用[19]。基于此，本研究以甲基丙烯酸酐化海藻酸鈉為支架材料、N-乙烯基吡咯烷酮（N-Vinyl-2-pyrrolidone，NVP）和積雪草苷為造孔劑，制備負載中藥單體的海藻酸鈉水凝膠，表征其基本理化性質，并從機械特性、生物相容性、細胞共培養等方面評價其性能，制備積雪草苷多功能型水凝膠支架。這是首次利用積雪草苷中藥單體與甲基丙烯酸酐化海藻酸鈉發生交聯共聚反應，通過反復冷凍-解凍法把這種交聯共聚固定下來，形成穩定的網絡狀水凝膠，從而改善凝膠成膠后的穩定性及機械強度。

1 實驗與方法

1.1 材料、試劑與儀器

海藻酸鈉，鹽酸，NVP，氫氧化鈉，甲基丙烯酸酐（均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養基，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）等均購自笛柏生物科技有限公司。

1.2 水凝膠的制備

在參考相關文獻[20]和前期實驗的基礎上已確定海藻酸鈉、甲基丙烯酸酐、NVP的最佳比例。現確定積雪草苷的最佳濃度，分別制備0、2、4、6、8 mg/mL積雪草苷復合水凝膠。觀察積雪草苷濃度對成膠的影響，確定到最適濃度。具體方法如表1。

本實驗共制備6個樣品，按表1配的不同濃度水凝膠。以甲基丙烯酸酐化海藻酸鈉水凝膠為實驗對照組，記Gel-1，加入NVP 和積雪草苷的水凝膠記Gel-2。以反復冷凍-解凍法制備水凝膠，具體過程為將配制的水凝膠EP 管放入-20℃的冰箱中冷凍24 h 后于4℃自然解凍，循環3 次。確保交聯徹底完成。

表1 水凝膠的組成（單位：mL）Table 1 Composition of the hydrogel（unit：mL）

1.3 測試與表征

1.3.1 成膠及pH的測定 采用試管傾斜法比較各水凝膠的成膠狀態。用試管量取2 mL各組水凝膠，溫度條件為37 ℃。將試管倒置，觀察水凝膠的流動性能，若不流動，則成膠穩定。測定各組水凝膠液態pH。重復3次，取平均值。

1.3.2 水凝膠溶脹率 在室溫條件下，稱取適量水凝膠，放入一定量的蒸餾水中，靜置一段時間后取出，去除水凝膠表面多余的水分，稱量得到溶脹水凝膠的質量[21]。計算水凝膠的溶脹率（Equilibrium Swelling Ratio，ESR）：

式中：ms——溶脹后水凝膠的質量，g；md——溶脹前水凝膠的質量，g。

1.3.3 水凝膠形貌觀察 將成膠完全的復合水凝膠固定在96 孔板樣品臺上，用LM-4XC 型倒置電子顯微鏡觀察復合水凝膠表面及內部多孔結構，縱切面孔隙大小及均勻程度。觀測不同濃度積雪草苷對水凝膠三維結構的影響。

1.3.4 細胞共培養與體外細胞毒性測試 大鼠腎小管上皮細胞52E 原代培養，將處于對數生長期的細胞用于評價水凝膠的細胞毒性。將52E細胞和復合水凝膠共培養1 d，3 d，5 d，移除舊培養基，添加WST-8、應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測試劑（Cell Counting Kit-8，CCK-8）。兩小時后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。以完全培養基作為陽性對照，根據細胞在復合水凝膠和完全培養基中的比值計算不同天數后細胞的存活率。

1.3.5 細胞活力的測定 以2 000 個/孔的接種量，將細胞接種在96 孔板中，用一系列濃度的藥物處理12 h。然后，向每個孔中加入10μLMTT試劑（5 mg/mL），并孵育4 h。之后，去除上清液。接下來，添加150 μL DMSO以溶解藍紫色結晶甲臜。用酶標儀測量540 nm處的吸光度值。

2 結果

2.1 水凝膠的成膠效果

試管傾斜法測試結果表明甲基化海藻酸鈉溶液與NVP、不同積雪草苷濃度溶液間均能通過反復冷凍-解凍形成凝膠。但穩定性各不相同，當積雪草苷含量為6 mg/mL時，Gel-2最穩定，隨著體系中積雪草苷含量增多，成膠穩定性下降。圖1展示了Gel-1和不同積雪草苷濃度Gel-2的成膠效果。pH測試結果顯示各組水凝膠樣品之間pH值沒有明顯差異。

2.2 水凝膠的表觀形貌

隨著積雪草苷含量增加，水凝膠的表面變得不平整，出現凹陷。從圖2放大圖片可以看出，當體系中積雪草苷含量增加到6 mg/mL，水凝膠內部的交聯越來越密集。進一步分析得出，隨著積雪草苷含量的增加，水凝膠內部孔隙直徑增大，孔壁變薄，交聯程度提高，形成了致密的三維網狀結構，表觀為穩定不可逆凝膠體。

圖1 復合水凝膠成膠圖Figure 1 Composite hydrogel formation diagram

圖2 不同積雪草苷含量復合水凝膠的倒置顯微鏡圖Figure 2 Inverted micrographs of composite hydrogels with different Centella asiatica glycosides content

2.3 水凝膠的溶脹和體外降解性能

由圖3 可知，浸潤起始階段（1～2 d），水凝膠的溶脹率成對數增加，顯示與浸潤時間密切有關。但2 d后，隨著浸潤時間增加，溶脹率穩定，幾乎成一條直線。此時水凝膠支架容納的水已經達到極限，溶脹率與時間無關。其次積雪草苷和交聯劑促使凝膠支架氫鍵網絡的形成，強化了組織間隙的強度，是不同溶脹率的結構基礎。當積雪草苷質量范圍為6 mg/mL時，溶脹率最高達到45%。

圖4 降解實驗結果顯示，降解起始階段（1～6 d），降解速率最快，各組水凝膠的質量損失逐漸增大，但質量損失率相差不大。降解第二階段（7～12 d），降解速率變緩，質量損失率差異開始顯現。降解第三階段（13 d后），各組質量損失率變化不明顯，Gel-1凝膠較Gel-2 凝膠降解多，質量損失率最高分別達65.7%、61.5%，說明積雪草苷對凝膠的降解有明顯的影響。但不同中藥單體含量，質量損失率沒有明顯差異。

圖3 復合水凝膠在不同浸潤時間的溶脹率Figure 3 Swelling rate of hydrogels at different wetting time

圖4 復合水凝膠的降解性能Figure 4 Degradation properties of hydrogels

2.4 細胞相容性分析

為了實現定量比較，利用CCK-8 法對Gel-1 和Gel-2 水凝膠進行了毒性測試和細胞共培養。選取腎小管上皮52E細胞作為細胞模型。由圖5可見，細胞和凝膠支架共培養1 d，3 d和5 d后的細胞存活率均接近甚至超過95%。當積雪草苷含量為6 mg/mL時，細胞存活率最高，證明制備的復合水凝膠具有優良的細胞相容性。

圖5 52E細胞和水凝膠共培養1d，3d和5 d后的細胞存活率Figure 5 52E cell viability of hydrogel microsphere after coculturing for 1，3 and 5 d

為了實現水凝膠表面細胞的附著，經過殺菌處理，將水凝膠鋪于96孔板中并加入等量培養基，然后分別加入同等數量的52E細胞使其黏附到水凝膠表面進行生長。由圖6 可見，培養1、3、7 d 后，通過共聚焦顯微鏡的不同通道觀察，可以明確看到52E 細胞在水凝膠表面進行了黏附，且細胞相容性好。培養1、3、7 d 后，細胞數量持續增加，說明細胞在復合水凝膠表面不僅能黏附，而且可以長時間保持足夠的活性，實現增殖。通過添加NVP 和積雪草苷進行交聯共聚反應，就可以實現細胞在3D水凝膠載體表面黏附和增殖。

通過與空白對照和實驗對照比較可看出，積雪草苷含量為6 mg/mL 時，其內部細胞增值速率最高，最適合細胞生長。共培養1 d后，通過倒置相差顯微鏡觀察發現，鏡下細胞形態清楚，呈鵝卵石樣，細胞銜接緊密，透明度及折光度良好；培養3 d后，細胞呈指數性生長，形態為多邊形或短梭形，體積較大，銜接緊密；黏附于表面的細胞呈取向性生長，形成單細胞層，水凝膠支架內的細胞呈三維生長，但Gel-1和Gel-2各組細胞的增殖狀態、形態存在差異（圖6）；培養7 d后，其生長周期、細胞形態及鏡下折光性變化不大（圖6）。

圖6 CCK-8法檢測不同培養組中52E的增殖活性Figure 6 Proliferative activity of 52E in different culture groups by CCK-8

如圖6 所示，在相同的培養時間條件下，實驗組（積雪草苷6 mg/mL）在第5 d 的細胞增殖活性最佳，且高于空白對照組和條件對照組（F＝3.187，P<0.05），空白對照組和條件對照組沒有明顯區別。第7 d時，實驗組細胞增殖活性比條件對照組高（F＝15.240，P <0.05），且條件對照組明顯高于空白對照組（P<0.05），表明水凝膠中積雪草苷的含量對52E細胞增殖具有促進作用。

通過倒置顯微鏡對細胞形態數據進行統計發現，各組水凝膠表面52E細胞鋪展的水平明顯不同。同一培養階段，積雪草苷濃度為6 mg/mL，梭形細胞數量增加，生長并連接成片，細胞鋪展面積增大，細胞圓度顯著增加。這些研究結果表明，一定濃度的積雪草苷能夠增強細胞的擴散行為[圖7（A1）～（A3）]。從[圖7（B1）～（B3）]高倍照片看出52E 細胞上出現的幾根絲狀偽足。偽足的形成起著關鍵作用，其有利于細胞在材料表面附著，沿著錨定的絲狀偽足引導延伸。貫通的孔道結構使接種在表明的細胞呈現向凝膠內部遷移的趨勢，這是能促進細胞遷移的重要前提。由此可見，含有積雪草苷三維網狀支架表面有利于細胞在其上進行附著、聯系及增殖，且良好的細胞相容性。

3 討論

圖7 52E細胞在復合水凝膠上的黏附、增殖Figure 7 Adhesion and proliferation of 52E cells on composite hydrogel observed

海藻酸鈉是具有三維網絡親水性的軟材料，可以在水或生物流體中膨脹。具有較好的保水性能，可以吸收傷口滲出物，從而促進真皮和表皮細胞的浸潤，使傷口重新上皮化。到目前為止，不同類型的水凝膠，如殼聚糖、海藻酸鈉已被開發為醫用材料。但僅用交聯劑形成的海藻酸鈉水凝膠機械強度差，水溶性低，其在臨床應用受到很大限制。因此，迫切需要找到一種機械強度好，具有穩定網絡結構，細胞相容性好的新型水凝膠。

據報道，小分子來自食品或草藥，如大黃素含有蒽醌結構，葛根素含有苯環和羥基，可以自發地組裝成3D 水凝膠[22-23]。這些超分子水凝膠具有自愈特性，高穩定性和環境響應性（溫度和pH 敏感性）對促進傷口愈合具有較好的效果[24]。類似地，富含鄰苯二酚或鄰苯三酚（包括單寧酸和沒食子酸（gallic acid，GA））的植物多酚已被廣泛報道通過使用酶的自聚合，紫外線（ultraviolet，UV）照射或使用弱堿性溶液形成納米涂層或納米顆粒[25]。這些酚類生物材料使載體具有出色的抗菌和抗炎活性，證明了它們在藥物遞送和生物成像應用中的潛力。酚類化合物也被接枝到殼聚糖或甲殼素等其他聚合物上，形成增強其機械和生物特性的水凝膠。然而，據我們所知，沒有報告顯示積雪草苷在現有情況下可以形成具有穩定三維網絡水凝膠。最近，我們發現積雪草苷與甲基丙烯酸酐化海藻酸鈉發生交聯共聚反應，在反復冷凍-解凍處理下組裝成多功能復合水凝膠，進一步改善凝膠成膠后的穩定性及機械強度。

水凝膠成交過程中先以甲基丙烯酸酐對海藻酸鈉中的羧基進行修飾，有利于交聯，這種交聯方法雖然可以改善凝膠成膠后的穩定性及機械強度，但成膠后吸水能力降低。再加入NVP和積雪草苷發生交聯共聚反應，然后通過反復冷凍-解凍作用把這種交聯共聚固定下來，形成穩定的網絡狀水凝膠。研究表明隨著中藥單體的增加，當積雪草苷含量為6 mg/mL水凝膠孔隙尺寸最大，孔壁較薄，達的孔隙結構為細胞提供高效物質交換通道，為細胞增殖提供更多空間。如將此復合凝膠用于傷口愈合，該網絡因吸水膨脹而填充組織缺損部位并為細胞提供支架[26]，對傷口的愈合作用及機制還需要進一步研究。此外還發現在一定的范圍內，復合水凝膠支架的交聯度隨著積雪草苷含量的增加而增大，促使凝膠支架網絡的形成，是不同溶脹率的結構基礎。當積雪草苷濃度為6 mg/mL 時，溶脹率最大達到45%。此穩定性致密三維網狀水凝膠，可進一步作為強化組織間隙強度的功能型水凝膠[27]。

水凝膠的表觀形貌顯示，積雪草苷對凝膠的內部交聯結構有顯著的影響。細胞相容性和增殖實驗結果也表明通過添加中藥單體進行交聯共聚反應，形成穩定網絡狀水凝膠，使細胞在復合水凝膠載體表面黏附和增殖，促進細胞遷移。此研究通過自組裝形式設計的水凝膠與傳統中藥活性成分結合，將中藥成分引入水凝膠體系，這些優勢都使水凝膠可作為出眾的傷口敷料候選者[28]。為海藻酸鈉向智能化、仿生化方向發展提供基礎理論研究，對加快天然支架材料在組織工程領域的實際應用具有極其重要的研究意義。此外，將中藥天然產物分子直接組裝成綠色凝膠的理念具有諸多理論優勢，期待為中藥現代化建設奠定基礎。

4 結論

本試驗以甲基丙烯酸酐化海藻酸鈉為水凝膠支架，添加NVP和積雪草苷制備出三維網狀復合水凝膠。結果表明：在甲基丙烯酸酐化海藻酸鈉、NVP最佳比例前提下，積雪草苷濃度為6 mg/mL 時，水凝膠支架凝膠時間最短、最穩定，復合水凝膠的孔隙尺寸增大。由于中藥單體與甲基丙烯化海藻酸鈉通過交聯形成了三維多孔結構，不同含量的積雪草苷對孔隙形態特點具有明顯的影響作用。

細胞相容性研究發現，該復合水凝膠支架無細胞毒性，可實現腎小管上皮細胞的增殖。黏附于表面的細胞呈取向性生長，形成單細胞層；水凝膠支架內的細胞呈三維生長。由于類似多細胞層結構常見于血管、神經等組織，結合中藥單體所制備的復合水凝膠有望在上述組織的修復中得到應用。良好的材料生物相容性和溫和的操作過程能夠保障黏附后的52E細胞在凝膠表面正常鋪展與增殖，顯示了在3D大規模培養細胞方面的應用潛力。