西格列汀通過上調TTF-1/SP-B通路對LPS誘導小鼠急性肺損傷的保護作用

王小川，杜發旺，姚 宇，李 麗，何高燕，王漢超，王 勤，熊 偉，朱 濤，3

1.遂寧市中心醫院呼吸與危重癥醫學科（遂寧 629000）；2.重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科（重慶 400010）；3.遂寧市中心醫院基礎實驗室（遂寧 629000）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是最常見的非心源性急性肺水腫，臨床上主要表現為呼吸窘迫與頑固性低氧血癥[1-2]。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和ARDS 是同一個疾病連續的兩個不同階段[3-5]。目前研究表明肺表面活性物質（pulmonary surfactant，PS）減少、肺順應性下降和通氣/血流失調是ALI/ARDS 最主要的病理生理特征[5-6]。PS是一種主要由Ⅱ型肺泡上皮細胞（type Ⅱalveolar epithelial cell，AEC Ⅱ）合成和分泌的大分子聚合物，其主要的生物學作用包括維持肺泡順應性、肺泡內外液體平衡、調控肺組織固有免疫等[7-8]。研究發現促進PS 的蛋白成分（如SP-A 和SP-B 等）表達或外源性給予PS 可有效改善ARDS 患者的氧合水平，促進肺水腫液的吸收[9-10]。我們前期研究證實在小鼠ALI 模型中，胰高血糖素肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）的擬似物利拉魯肽（liraglutide）可通過上調甲狀腺轉錄因子-1（thyroid transcription factor，TTF-1）信號通路改善肺損傷，減輕肺組織炎癥[11]。同時，研究證實在腸道細胞中二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4；又稱CD26）是GLP-1代謝的關鍵酶。DPP4抑制劑（如西格列汀和沙格列汀等）可有效降低DPP4 活性，從而抑制GLP-1 的分解，增加組織中GLP-1 濃度和存留時間[12-13]。因此，本研究的目的是探討DPP4抑制劑西格列汀對小鼠ALI的保護作用以及潛在的分子機制和信號通路，為臨床治療ARDS提供新線索和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料

實驗動物SPF級雄性BALB/C小鼠，由四川大學實驗動物中心提供。DPP4 抑制劑西格列汀購于美國默沙東制藥公司（捷諾維，國藥準字J20140095）。內毒素（LPS）購于美國Sigma公司。聚合酶鏈反應（PCR）引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。總RNA 抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。第一鏈cDNA 合成試劑盒和PCR 試劑盒購于Takara 公司。小鼠TTF-1 抗體、SP-B 抗體和β-actin 抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 小鼠模型的建立

按照隨機數字表法將32只雄性BALB/C 小鼠分為對照組、DPP4抑制劑西格列汀組（DPP4I組）、內毒素組（LPS組）和LPS+DPP4I組，每組8只。根據我們的前期研究方案，LPS 組和LPS+DPP4I 組小鼠通過氣道內注射LPS（10μg LPS 溶于50μL 生理鹽水）誘導建立ALI模型[14-15]。LPS 干預72 h 后處死小鼠獲取標本。干預開始7 d前，灌喂DPP4I組和LPS+DPP4I組小鼠西格列汀（100 mg/kg，1 次/d），直到處死小鼠獲取標本，共10次[16-17]。對照組給予生理鹽水代替LPS。動物實驗方案經遂寧市中心醫院動物倫理委員會審核批準。

1.3 HE染色觀察病理變化并進行肺損傷評分

取左肺下葉，根據我們前期研究，采用HE 染色觀察肺組織病理改變[18]，對肺損傷程度進行評分[3-4，11]。

1.4 肺泡灌洗液炎癥細胞分類計數

根據前期研究方案，收集小鼠肺泡灌洗液（BALF），采用Diff-Quik 染色，使用血細胞計數器（hemocytometer）對BALF的細胞總數、中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞進行計數[19-20]。

1.5 肺組織濕/干比測定

根據前期研究方案，小鼠處死后取出肺組織，將小鼠右中肺置于80 ℃烤箱24 h至恒重后，記錄前后肺組織重量，計算肺組織濕/干比（W/D）值[3，11]。

1.6 qPCR法檢測TTF-1、SP-B表達

取右肺上葉組織，按照試劑盒說明書提取總RNA。以總RNA為模板，用Oligo（dT）18作為引物，按照試劑盒說明書介紹要求合成cDNA第1鏈。TTF-1：正義5'-AACAGC GGCCATGCAG CAGCAC-3'，反義5'-CCATG TTCTTGC TCACGTCC-3'；SP-B：正義5'-CCAAGTGCT TGATGTCTACC-3'，反義5'-CTGGATTCTGTTCTGGCT TA-3'；β-actin引物：正義：5'-GATTA CTGCTCTGGCT CCTAGC-3'，反義：5'-ACTCAT CGTACTCC TGC TTGC T-3'。使用β-actin 作為內參基因，采用2-△△CT公式計算目標基因肺組織TTF-1 和SP-B 的相對表達量，ΔΔCt=（Cttarget-Ctβ-actin）干預組-（Cttarget-Ctβ-actin）對照組[20-21]。

1.7 Western blotting法檢測肺組織蛋白表達

按照試劑盒操作要求，首先提取右肺下葉組織總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，放入兔抗鼠單克隆抗體磷酸化TTF-1（1∶800）和β-actin（1∶2 000）稀釋溶液中4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000），用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.8 統計學方法

計量資料以均數±標準差描述。采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析，兩樣本均數多重比較采用SNK法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織損傷水平

對照組與DPP4I 組小鼠肺組織未見明顯病理變化。LPS組：肺泡間隔明顯增寬、肺泡內大量炎癥細胞浸潤和水腫液聚集，并見較多紅細胞，肺泡中有透明膜形成。LPS+DPP4I組：肺泡間隔增寬、肺泡內炎癥細胞浸潤和水腫液聚集程度均較LPS 組更輕，肺泡內見少量透明膜形成。與LPS 組相比較，LPS+DPP4I 組的肺損傷評分更低，差異有統計學意義（P <0.05），見圖1和圖2。

圖1 肺組織HE染色（×200）Figure 1 HE staining of lung tissue（×200）

圖2 肺損傷評分Figure 2 Lung injury scores

2.2 BALF中炎癥細胞水平

LPS 干預72 h 后，小鼠BALF 中細胞總數、中性粒細胞數、巨噬細胞數和淋巴細胞數均顯著升高（P <0.05）。與LPS組相比，LPS+DPP4I組小鼠BALF中各種炎癥細胞數均明顯更低，差異有統計學意義（P <0.05），見圖3。

圖3 BALF中炎癥細胞Figure 3 Inflammatory cells in BALF

2.3 肺組織W/D比值

W/D 比值是評估小鼠ALI 模型肺水腫嚴重程度的常用指標[3，11]。LPS干預72 h后，小鼠肺組織W/D比值顯著增加（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+DPP4I 組小鼠肺組織W/D比值明顯降低（P<0.05），見圖4。

2.4 肺組織TTF-1和SP-B的表達水平

與對照組相比，LPS 干預后小鼠肺組織TTF-1 和SP-B mRNA 和蛋白表達水平均明顯下降（P <0.05）。與LPS組相比，LPS+DPP4I組小鼠肺組織TTF-1和SPB更高（P<0.05），見圖5和圖6。

圖5 肺組織TTF-1和SP-B mRNA和蛋白表達水平Figure 5 The mRNA and protein expression of TTF-1 and SP-B in the lung tissue

圖6 肺組織TTF-1與SP-B的western blotting結果Figure 6 The western blotting results of TTF-1 and SP-B

3 討論

ARDS 一直是呼吸與危重癥醫學研究的重點及難點，目前研究顯示其死亡率高達30%～70%[1]，主要的病理生理特征包括肺容積減少、肺泡塌陷、肺組織順應性下降、高通透性肺水腫、氧合功能障礙和肺循環障礙等，臨床以呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫為主要表現[3，14，22]。

GLP-1 是腸道內分泌細胞L 細胞（L cells）和K 細胞（K cells）分泌的一種腦腸肽，是重要的胰島素促分泌劑，GLP-1對于糖脂代謝具有關鍵調控作用，生理狀態下高脂肪和高碳水化合物食物是促進GLP-1合成與分泌的主要調節因素[23-25]。二肽基肽酶4（DPP4）（即CD26）是一種抗原酶，在多個器官的細胞表面以II型跨膜蛋白的形式表達，是GLP-1代謝的關鍵酶[26]。因此，DPP4 抑制劑可延長腸促胰島素激素如GLP-1 和胃抑制多肽等的生物活性，從而改善機體的葡萄糖耐量[26]。目前GLP-1 擬似物與DPP4 抑制劑均已被廣泛用于II型糖尿病的治療。我們前期研究發現GLP-1擬似物利拉魯肽可有效減輕LPS 誘導的小鼠ALI 模型肺組織炎癥反應及肺水腫水平[11]。同時，多個研究表明DPP4抑制劑對于多種因素導致的肺部炎癥反應具有調控作用[16，27]。KONG等[16]研究發現DPP4抑制劑西格列汀可以有效減輕重癥胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）誘導的ALI 模型小鼠的肺組織損傷、肺水腫和氧化應激水平。ZHANG 等[27]研究顯示高選擇性DPP4抑制劑阿拉格列汀（anagliptin）對于LPS 誘導的人肺微血管內皮細胞（human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMVEC）炎癥反應和氧化應激損傷有顯著的保護作用。在本研究中，我們發現與LPS 組相比，LPS+DPP4I組小鼠的肺組織病理改變程度、肺損傷評分、肺水腫程度指標W/D 比值及BALF 中各炎癥細胞水平均明顯更低。該結果表明西格列汀可以有效緩解LPS 誘導的ALI小鼠模型肺損傷和肺水腫程度及炎癥反應水平。

PS成分主要包括磷脂和蛋白兩部分，其中SP-A和SP-B 是PS 最主要的蛋白組分[11，28]。PS 具有降低氣液界面的表面張力維持肺泡順應性、調控肺內液體平衡和肺組織固有免疫反應等生理學作用[11，28]。研究顯示ARDS 患者的肺組織和血中SP-A 和SP-B 水平均明顯降低，其水平與ARDS的嚴重程度呈負相關[29-30]。YANG等[29]的研究發現ARDS 患者血清中SP-A 和SP-B 水平較健康體檢者明顯下降，同時ARDS關鍵炎癥因子IL-8 的水平與SP-A 和SP-B 水平呈顯著負相關。我們前期研究發現在ARDS 存活組患者的氧合指數與BALF中SP-A 水平均較死亡組明顯更高[30]。進一步進行相關性分析后發現兩者之間的決定系數（R2）為0.531，因此BALF中SP-A水平與ARDS嚴重程度具有顯著正相關性，該指標是ARDS 嚴重程度的潛在標志物。外源性給予包含SP-B的肺表面活性物質對ALI/ARDS肺損傷具有保護作用。BEZERRA 等[31]研究證明包含SP-B和SP-C的外源性PS藥物CUROSURF 可有效緩解高濃度氧誘導的ALI 小鼠模型肺組織損傷、炎癥及氧化應激水平，提示CUROSURF 對于ARDS 具有良好的治療前景。在本研究中我們也發現LPS 誘導的ALI 肺組織SP-B 明顯降低，但西格列汀可有效改善LPS 誘導ALI小鼠肺組織中SP-B的下降。

TTF-1屬于NKX2同源結構域轉錄因子家族，是調控肺組織發育、分化及肺表面活性物質合成的關鍵轉錄因子[11]。TTF-1 敲除小鼠由于肺組織、甲狀腺和腦組織發育嚴重障礙在出生后迅速死亡[32]。研究顯示SP-A和SP-B基因轉錄區存在TTF-1結合序列，TTF-1對于SP-A 和SP-B 的合成與分泌具有關鍵調控作用[33]。我們前期通過動物和細胞模型試驗證實GLP-1擬似物利拉魯肽主要是通過上調AEC II細胞TTF-1信號通路促進SP-A的分泌與合成減輕了ALI肺損傷、肺水腫及炎癥反應[11]。基于此，我們在本研究中發現DPP4抑制劑西格列汀亦可有效上調LPS誘導的ALI模型小鼠肺組織TTF-1 mRNA 和蛋白的表達水平。因此，我們推測西格列汀對于LPS誘導ALI小鼠肺組織的保護作用可能主要是通過上調TTF-1 促進SP-B 合成實現的。

4 結論與展望

本實驗結果發現，在LPS 誘導的小鼠ALI 模型中DPP4 抑制劑西格列汀可以通過上調肺組織TTF-1 表達，促進SP-B合成，有效減輕肺損傷、炎癥反應和肺水腫。下一步我們將在體外研究中繼續探討DPP4 抑制劑對于ARDS 狀態下II 型肺泡上皮細胞的保護作用及潛在的分子機制。該系列研究有望為DPP4 抑制劑及GLP-1擬似物應用于ARDS臨床治療提供理論依據，并為后續的臨床研究奠定基礎。