疏肝利膽顆粒提取工藝優選及藥效學實驗研究

張玉春，靳永文，王利軍，張國強，張 帆，魏玉輝

蘭州大學第一醫院藥劑科（蘭州 730000）

膽汁淤積性肝損傷是一種常見的肝病，發病率較高，全球約10%～ 20%的人受膽汁淤積癥的困擾[1-2]。膽汁淤積（cholestasis）是由膽汁合成缺陷和/或排泌異常造成膽酸鹽在肝臟中蓄積，長期蓄積可對肝細胞造成損傷，導致肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[3]。目前，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于治療膽汁淤積的藥物僅有熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）和奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA）[4-6]，但其療效不盡如人意[7-8]。因此，面對膽汁淤積癥治療藥物療效欠佳的問題，仍需尋找更加安全有效的治療藥物。

中醫藥在膽汁淤積性肝損傷的治療中療效顯著[9]，其主要方法為清熱燥濕、保肝利膽[10]。消炎利膽丸方是蘭州大學第一醫院院內中藥制劑，經40 年臨床驗證，在治療膽石癥、膽囊炎和膽汁淤積方面療效明確、毒副作用小且患者認可度高。該方由柴胡、木香、炒枳實、青皮等8味中藥組成。然而，消炎利膽丸為大蜜丸劑，吞咽困難者或兒童服用不便，且限制了糖尿病患者的使用。為了促進消炎利膽丸由院內制劑走向市場，讓更多膽石癥、膽囊炎和膽汁淤積患者受益，有必要將其進一步開發為不含糖、便于服用、攜帶方便的醫院制劑。本課題組為了將消炎利膽丸劑改進為疏肝利膽顆粒劑，采用正交設計結合藥效學實驗評價并優選疏肝利膽顆粒的提取工藝，為疏肝利膽顆粒的開發提供科學實驗依據。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀；LT-224S 電子天平（Sartorios 公司，BS 400S）；Varioskan Flash 多功能酶標儀（美國Thermo公司）；脫水機（TP1020型，德國萊卡公司）；石蠟包埋機（HBM～200LF 型，上海寰熙醫療器械有限公司）；全自動生化儀（AU400 型，日本Olympus公司生產）；高速離心機（3K15型，德國Sgima離心機公司）；核酸蛋白定量儀（Nano Vue 型，美國通用電器醫療）；PCR 熱循環儀（Pro Flex 96-well PCR system 型，美國ABI公司）；熒光定量PCR儀（480-480Ⅱ型，羅氏）。

1.2 試藥與試劑

柴胡、枳實（炒）、木香、菜菔子、青皮、山楂、大黃、芒硝均購自甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，藥品生產許可證號：甘20160006，藥品GMP證書：GS0140122，均符合《中國藥典》2020 年版規定；大黃素對照品，批號110756-200110，質量分數98%，中國藥品生物制品檢定所；大黃酚對照品，批號110796-200716，質量分數98%，中國藥品生物制品檢定所；RNA 提取試劑盒，批號DP431，天根生化科技有限公司；快速反轉錄試劑盒，批號KR116-02，天根生化科技有限公司；熒光定量試劑，批號32597600，羅氏公司；BCA 試劑盒，批號SL260217，Thermo；α -異硫氰酸萘酚 (alphanaphthylisothiocyanate，ANIT)，N106389，質量分數98%；消炎利膽丸劑由蘭州大學第一醫院藥劑科提供；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒、谷草轉氨酶（AST）測定試劑盒和總膽酸鹽（TBAs）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；色譜級乙腈和甲醇均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；分析純水為蘭州大學第一醫院自制，其他試劑均為國產分析純；去離子水（蘭州大學第一醫院自制）。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠（5～ 7 周齡，體重20～25 g）由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所提供[許可證編號：SCXK（甘）2015-0021]，于室溫20℃～25℃及濕度40%～60%的條件下飼養1周后開始實驗。本研究遵守動物實驗倫理要求，并經蘭州大學第一醫院倫理委員會審核批準（審批號：LDYYLL2023-227）。

1.4 方法

1.4.1 大黃素和大黃酚含量的測定 色譜條件：Ulitmate XB-C18 色譜柱，乙腈-甲醇-0.1%磷酸（42∶23∶35）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長為254 nm。對照品溶液的制備：稱取一定量的大黃素和大黃酚對照品，精密

稱定，加甲醇溶解，得質量濃度為0.1 mg/mL 的儲備溶液；供試品溶液的制備：稱取水提物干膏（過四號篩）約0.1g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲40 min，放冷，再加甲醇定容。取供試品溶液，過濾，精密量取續濾液10 mL，置燒瓶中，加30 mL 的1 mol/L 鹽酸溶液，20 mL 的三氯甲烷，加熱回流1 h，冷卻后分取三氯甲烷，水層再加三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并提取液，蒸干，加入甲醇復溶，轉入10 mL容量瓶中，定溶；陰性對照樣品溶液的制備：按處方比例稱取各味藥材（不含大黃），按制劑提取方法提取，稱取干膏適量，按“供試品溶液的制備”方法制得陰性對照樣品溶液。

1.4.2 大黃素和大黃酚測定方法學評價 吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照樣品溶液10μL 進樣分析；標準曲線的制備：取“1.4.1”項對照品溶液梯度稀釋為0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL，測定；精密度試驗：取“1.4.1”項對照品溶液，稀釋至0.16μg/mL，重復測定6 次；穩定性試驗：取供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12、24 h 測定；重復性試驗：稱量水提干膏粉末6份，精密稱定，按照“1.4.1”項方法制備供試品溶液，測定；加樣回收率試驗：稱量水提干膏粉末6份，精密稱定，分別對照品溶液（0.16μg/mL）10 mL，按照“1.4.1”項方法制備供試品溶液，測定并記錄大黃素和大黃酚的峰面積，并計算RSD 值。

1.4.3 水提工藝優選 水提工藝單因素考察：根據文獻報道[11]對水提工藝影響較大的主要因素為加水量、提取時間、提取次數。提取時間：選擇提取時間0.5、1.0、1.5 h 進行正交試驗；加水量：選取加水量為10、8、6 倍量進行正交試驗；提取次數：選取提取次數為1、2、3 次進行正交試驗；正交試驗篩選最佳水提工藝：以得膏率、大黃素和大黃酚轉移率為評價指標，以提取時間（A）、加水量（B）和提取次數（C）為考察因素，應用L9(34)表進行正交試驗，篩選出最佳的提取工藝；并進行3 次重復驗證試驗。

1.4.4 藥效學實驗驗證 消炎利膽方水提物制備：以上8 味藥，稱取柴胡36 g，枳實（炒）30 g，木香30 g，菜菔子30 g，青皮30 g，山楂36 g，大黃30 g，芒硝24 g(后下)，按照最優水提工藝制備消炎利膽丸方水提物，置4℃冰箱備用；動物分組與給藥：小鼠飼養1 周后，采用隨機分組法將小鼠分為6 組，每組10 只，對照組灌胃給予溶媒（純化水）；模型組灌胃給予溶媒（純化水）；低劑量組灌胃給予水提物0.22 g·kg-1·d-1；中劑量組灌胃給予水提物0.45 g·kg-1·d-1；高劑量組灌胃給予水提物0.90 g·kg-1·d-1；丸劑組灌胃給予中劑量消炎利膽丸2.0 g·kg-1·d-1，每天兩次，連續7 d；給藥第5 d，模型組和給藥組小鼠單次灌胃給予ANIT 50 mg/kg，對照組給于等體積的植物油；末次給藥后，禁食4 h，摘眼球采血，二氧化碳致死，觀察膽囊充盈狀態，采集肝臟組織，部分組織儲存于-80℃中，部分組織固定于10%甲醛溶液，用于肝臟組織病理學考察。試劑盒測定血清中谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和總膽汁酸（total bile acid，TBAs）的水平；按照TIANGEN RNA prep Pure 動物總RNA 提取試劑盒的方法測定小鼠肝臟炎癥因子mRNA 水平；采用離心柱法對小鼠肝臟進行裂解提取總RNA，并進行RNA 反轉錄和RNA 擴增；以GAPDH 作為內參基因計算各基因的mRNA 表達量。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0 進行統計學分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，兩組均數差異比較采用ttest雙尾檢驗法，P<0.05 和P<0.01 為有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素和大黃酚測定方法學評價

方法學考察結果顯示大黃素保留時間為17.16 min，大黃酚保留時間為26.61 min，且與供試品其他組分分離度良好（R ＞1.5），陰性對照品無干擾（見圖1）。以色譜峰面積為縱坐標（Y），對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得大黃素和大黃酚線性回歸方程分別為Y＝272287 X -19675，r2＝0.9987 和Y＝447222 X -36583，r2＝0.9982，大黃素和大黃酚在0.08～10.00μg/mL 線性關系良好。精密度考察結果表明，大黃素和大黃酚RSD 分別為0.18%和0.31%；穩定性考察結果表明，大黃素和大黃酚RSD 分別為1.16%和2.24%；重復性試驗結果表明，干膏中大黃素和大黃酚平均質量分數分別為1.67 mg/g 和0.83 mg/g，RSD 分別為1.09%和2.16%；加樣回收率試驗結果大黃素和大黃酚的平均回收率分別為98.77%和101.41%，RSD分別為1.33%和2.19%。

圖1 大黃素和大黃酚色譜圖Figure 1 HPLC of emodin and chrysophanol

2.2 正交試驗與重復實驗驗證

由正交試驗直觀分析表明，各因素不同水平影響由大到小分別為A3＞A2＞A1、B1＞B2＞B3、C3＞C2＞C1。綜合評分表明最佳水提工藝為A3B1C3（結果見表1、表2），即稱取處方量藥物，加入10倍量水煎煮3 次，每次1.5 h。重復實驗測得得膏率平均值為25.44%，RSD 為1.41%；大黃素和大黃酚轉移率平均值分別為11.56%和12.03%，RSD 分別為1.18%和0.95%。結果顯示驗證試驗結果和正交試驗篩選的提取工藝評分最大值相近，說明疏肝利膽顆粒水提工藝穩定、可靠（見表3）。

表1 水提工藝正交試驗結果Table 1 Orthogonal experiment result of water extraction technologies

表2 水提工藝方差分析Table 2 Variance analysis of water extraction technologies

表3 水提工藝驗證試驗結果Table 3 Verification test of water extraction technologies

2.3 對小鼠膽囊的形態學評估

如圖2 所示，相較于對照組，模型組小鼠膽囊膨大，且膽汁呈墨綠色；與模型組相比，給予水提物低、中、高劑量和消炎利膽丸干預7 d 后，小鼠膽囊明顯縮小，膽汁顏色轉變為淺黃色。

圖2 小鼠膽囊形態學的變化情況Figure 2 Effects on gallbladder morphology in mice

2.4 對血清生化指標水平的影響

結果如圖3所示，與模型組相比，水提物低劑量組小鼠血清中ALT 水平顯著降低（P<0.05），其中TBA、ALP、AST 和ALT 水平分別下降了30%、28%、38%和46%；水提物中劑量組小鼠血清中TBA、AST 和ALT水平顯著降低（P<0.05），其中TBA、ALP、AST 和ALT分別下降了51%、43%、31%和13%；水提物高劑量組小鼠血清中ALP、AST 和ALT 水平顯著降低（P<0.05），其中TBA、ALP、AST 和ALT 分別下降了40%、44%、36%和48%。與模型組相比，消炎利膽丸劑中劑量組小鼠血清中TBA、AST 和ALT 水平顯著降低（P <0.05），其中TBA、ALP、AST 和ALT 分別下降了54%、42%、56%和59%，水提物中劑量和水提物高劑量與消炎利膽丸劑中劑量對膽汁淤積小鼠血清生化指標水平的影響作用相近。

2.5 對小鼠肝臟組織病理學的影響

如圖4 所示，肝臟組織病理學表明對照組肝臟組織結構及肝細胞形態清晰，模型組肝臟組織可見明顯的肝細胞嗜酸變、炎癥浸潤和肝竇擴張。與模型組相比，水提物低、中和高劑量組的炎癥浸潤、肝竇擴張程度明顯減輕，其中以中劑量組效果最明顯；消炎利膽丸劑組肝組織炎癥浸潤、肝竇擴張程度減輕。

圖3 小鼠血清生化指標變化情況（，n=10）Figure 3 Effect on biochemical index in serum of mice（，n=10）

圖4 肝臟組織病理學圖片（40×）Figure 4 Effects on gallbladder morphology in mice（40×）

2.6 對炎癥因子mRNA表達水平的影響

RT-PCR反應所需引物序列如表4所示，結果如圖5 所示，與正常組相比，模型組肝臟組織中的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6、（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素10、（interleukin-10，IL-10）-和一氧化氮合成酶（inductible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA水平顯著升高（P<0.001）；與模型組相比，經水提物低劑量治療后，肝臟組織中IL-6 的mRNA 水平顯著降低（P<0.05），IL-1β和iNOS mRNA水平降低但無顯著差異；經水提物中劑量治療后，肝臟組織中TNFα、IL-1β和iNOS的mRNA水平顯著降低（P<0.05），IL-6的mRNA 水平降低但無顯著差異；經水提取物高劑量治療后，肝臟組織中IL-1β 和iNOS 的mRNA 水平顯著降低（P<0.05），TNFα 和IL-6 mRNA 水平降低但無顯著差異；經消炎利膽丸中劑量治療后，肝臟組織中IL-1β 和iNOS 的mRNA 水平顯著降低（P<0.05），IL-6 的mRNA 水平降低但無顯著差異，水提物中劑量和水提物高劑量與消炎利膽丸劑中劑量對膽汁淤積小鼠肝臟組織炎癥因子的基因表達水平影響作用相近。

表4 RT-PCR反應所需引物序列Table 4 Primer sequences in real-time PCR analysis

圖5 小鼠肝臟組織中炎癥因子mRNA表達水平（，n=3）Figure 5 The mRNA expression levels of inflammatory factors in mouse liver tissue（，n=3）

3 討論

中藥復方制劑成分復雜，需要選擇合理、客觀、科學的指標反映復方制劑提取工藝的優劣，一般以有效成分及干膏得率作為提取工藝評價指標[12]。本研究選用水提法作為提取方法主要基于中藥水提物更能體現傳統中醫藥特色，且能保障制劑的安全性和有效性。應用正交實驗優選水提工藝，大黃素和大黃酚轉移率越高，提取效率越高，可作為考察提取工藝的主要評價指標，同時，以干膏得率為次要指標，通過正交實驗對中藥組方水提工藝進行了優化篩選，綜合評價了實驗結果和方法的可行性，并通過重復性的驗證實驗最終確定了最佳水提取工藝為用10 倍藥材量水提取3 次，每次1.5 h，該工藝穩定。以往制劑工藝研究中，主要考察提取物中某一個或幾個化學成分和得膏率的變化對提取工藝進行優化[13-14]，中藥復方制劑成分復雜，應用單個或某幾個化學成分為主要評價指標，有可能會導致評價結果的局限性，因此，本實驗采取指標成分結合藥效學實驗對疏肝利膽顆粒的提取工藝進行優選。

膽汁淤積癥是由于膽汁久滯、濕熱熾盛所致[15]。膽汁淤積可激活巨噬細胞產生促炎介質，如TNF-α、IL-1β、IL-6 等細胞因子，加重肝臟炎癥和損傷[16]。ANIT 是一種化學性肝毒性藥物，其誘導的小鼠肝內膽汁淤性肝損傷與藥物引起的人膽汁淤積性肝損傷發病機制相似[17]。血清AST、ALT、ALP 和TBA 水平是評價膽汁淤積肝損傷的常規指標[18]。ANIT 可引起小鼠血清ALT、AST 和ALP 水平顯著增高[19]。本研究結果表明，與空白組相比，模型組血清中TBAs、ALP、AST 和ALT 水平顯著升高，肝臟組織中TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10 和iNOS 基因表達水平顯著升高，肝臟病理學結果顯示，肝組織灶性區域肝竇擴張淤血和肝小葉內可見橋接狀壞死，表明此時小鼠膽汁淤積型肝損傷模型建立成功。膽汁淤積的中藥治療主要以行氣開郁、疏肝利膽、清熱化濕為主。消炎利膽丸方中柴胡具有疏散風熱，疏肝解郁，升舉陽氣，其主要成分柴胡皂能通過降低炎癥因子水平和轉氨酶水平發揮保肝作用[20-21]。青皮具有調節奧狄氏括約肌，加快膽汁排泄的作用[22]。大黃具有瀉下利膽、抗菌抗炎和保肝的功效[23]。木香具有明顯的利膽和抗炎作用[24]。芒硝可瀉下通便、清火消腫，適用于胃腸道疾病[25]。本實驗采用ANIT 誘導小鼠膽汁淤積模型進一步明確消炎利膽丸方水提物在緩解膽汁淤積性肝損傷中的作用。研究結果顯示，與模型組相比，給予不同劑量水提物和消炎利膽丸中劑量干預7 d后，小鼠血清生化指標水平和肝組織炎癥因子mRNA 水平顯著降低，肝組織病理學結果表明水提物可明顯減輕肝組織病理學損傷程度，表明采用正交實驗篩選的水提工藝獲得的消炎利膽丸方水提物對ANIT 誘導的小鼠膽汁淤積性肝損傷具有明顯保護作用，其機制可能是通過促進膽汁酸外排，減輕肝內膽汁酸負荷，恢復肝內膽汁酸穩態有關。此外，本研究結果還顯示出通過抑制肝臟TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10和iNOS基因表達能減輕炎癥反應。

4 結論

本研究通過正交實驗篩選出的水提工藝可作為消炎利膽丸方的最優水提工藝，且獲得的水提物對ANIT誘導的小鼠膽汁淤積性肝損傷具有明顯保護作用。消炎利膽丸方劑水提工藝的優化有利于疏肝利膽顆粒的開發，并為膽汁淤積的臨床治療提供了更優的治療藥物選擇。