先天性巨結腸細胞治療研究進展

何雨晨 蔡多特 張書豪 金 益 高志剛 邵 敏

先天性巨結腸（Hirschsprung disease，HD）是一種腸神經系統發育障礙導致的先天性結構畸形，是造成新生兒和嬰幼兒腸梗阻的主要原因，在全球新生兒的發病率約為1/5 000～1/3 500，亞洲人群發病率最高［1］。HD 是胚胎發育階段遠端腸道缺少神經細胞定植導致［2］，依據無神經節細胞腸段的長度可分為短段型、長段型和全結腸型［3］。目前，公認的HD 治療方式仍是外科手術，通過外科手術可將無神經節細胞的腸段切除，并將正常腸段與肛管吻合。常用的根治手術術式有Swenson、Duhamel、Soave 和Rehbein 等［4］。近十年來，隨著微創技術的推廣，傳統根治手術得到了改良，腹腔鏡輔助技術使HD 根治術的解剖精度有了極大的飛躍，術后頑固性便秘和小腸結腸炎等并發癥發生率在一定程度上改善，但仍不能徹底消除，而且大便失禁、泌尿系統損傷等手術導致的副損傷仍時有發生，一旦發生則嚴重影響HD 患者的術后生活質量［5］。非手術方式治療HD 是一種減少手術創傷、避免手術副損傷的前沿醫學研究，也是臨床醫師追尋期許的治療新策略，細胞治療就是其中一種，其潛在優勢在于不僅可以有效規避外科手術相關的不良預后，還能最大程度地重建腸道神經結構以及恢復腸道功能，現已成為HD新治療策略的研究熱點［6］。本文擬從細胞來源、問題與挑戰、總結與展望3 方面對HD 細胞治療的研究進展進行綜述。

1 細胞來源

再生醫學的快速發展為HD 的治療帶來了一種基于細胞層面的新策略，目前可用于HD 治療的細胞類型有多能干細胞（pluripotent stem cells，PSC）、腸神經嵴來源細胞（entericneural crest-derived cells，ENCDC）等。除此之外，Pan 等［7］發現來源于HD 患者無神經節細胞腸段表達PLP1 的施旺細胞擁有分化潛力，可以將其分化出的神經嵴細胞（enteric neural crest cells，ENCC）移植回HD 患者的腸段用于治療。

1.1 PSC PSC 可分為誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）和人胚胎干細胞（human pluripotent stem cells，hPSC），PSC 的增殖能力使其在細胞療法中潛力巨大。相較于其他細胞來源的細胞治療方法，PSC 的一個重要優勢在于可以通過基因編輯（例如Crisper/Cas9 基因編輯技術）的方式糾正HD 相關的基因突變［8］，也為從基因水平研究HD 的發病機制提供了便利。早在2007 年，Takahashi 等［9］通過4 種逆轉錄因子——Oct3/4、Sox2、Klf4 以及c-Myc 將成人的體細胞重新編碼為多能干細胞，且與hPSC 有著相似的形態、基因表達、端粒酶活性等。科學家為了減少HD 患者移植后機體的免疫排斥反應，嘗試利用hPSC 對患者病變腸管進行細胞治療，Fattahi 等［10］通過抑制hPSC 的轉化生長因子β，將其分化為ENCC 并移植到HD 小鼠（Ednrbs-l/s-l），成功降低了小鼠HD 相關死亡率。Frith等［11］則在此基礎上發現維A 酸可以更快速地通過抑制骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）水平，高效地在體外誘導出ENCC，并可在腸道內定植，優化了PSC 細胞來源的細胞治療策略。雖然PSC 分化成ENCC 的速度得到了顯著提升，但是PSC 分化方向的不確定性導致其誘導產生有效ENCC 的數量不足，這始終是困擾科學家們的一大難題。Lau 等［12］建立了一種新型的實驗算法，可以為hPSC 分化成ENCC 提供指導，其發現Hedgehog 信號通路可以追蹤未成熟的ENCC 過渡到成熟ENCC 以及從ENCC 發育成腸神經元的過程，在利用hPSC 對HD 患者進行細胞治療時，可以利用這一算法指導ENCC 譜系以最大產量向著最適配的功能分化。而在全結腸型危重HD 的細胞治療中，Fan 等［13］通過在HD 小鼠（Ednrb KO/NSG，腸道神經節細胞缺乏從結腸延伸到小腸）盲腸內注射hPSC 來源的迷走神經嵴細胞（vagal neural crest cells，VNC）和骶骨神經嵴細胞（sacral neural crest cells，SNC）的等比例混合液，顯著延長了與單一注射VNC 或SNC 相比小鼠的存活時間，為全結腸型危重HD 患者的細胞治療方法增添了新思路。

1.2 ENCDC 在腸道神經發育過程中，ENCDC 在腸管中受到遺傳和環境因素影響，被多種信號通路調節（如一部分ENCDC 會表達結腸癌缺失基因（deleted in colorectal cancer，DCC）受體，其介導的軸突導向因子信號通路是ENCDC 在腸道進行放射狀遷移到黏膜下肌層所必需的），從而沿著整個腸道進行增殖、分化并遷移，最終形成腸道神經元和神經膠質細胞［14］。近幾年，已經有研究證實人類機體來源的ENCDC 移植入小鼠無神經節細胞的腸段，受腸段的微環境影響，移植的ENCDC 會向無神經節細胞的病變腸段遷移，改善HD小鼠的腸道癥狀，甚至能達到治愈的效果［15-17］。但是由于HD 腸道炎癥和腸道菌群紊亂等原因，ENCDC 短期定植到HD 腸段會發生大規模的凋亡。Tian 等［18］研究發現借助糞便微生物可以增加短鏈脂肪酸通過MEK1/2 信號改善ENCDC 定植存活率低的問題。除此之外，也有科學家［19-20］提出調節HD 腸段內細胞生態位分子水平及細胞外基質-細胞相互作用，對維持ENCDC 移植發育的良好微環境，提高ENCDC 定植成功率有重大意義。國內外科學家對于ENCDC 的最佳來源也展開了各種研究。Cheng 等［21］研究發現，黏膜下和肌間神經叢的ENCDC 擁有相似的分化潛能，Wilkinson 等［22］研究團隊從HD 無神經節細胞的腸段中分離出可以用來細胞治療的ENCDC，且與正常腸段中分離出的ENCDC 一樣具有分化和遷移能力。

目前，在模式動物中植入ENCDC 的相關研究已經取得較大進展，已經有報道［23］用野生型小鼠作為移植供體，成功地將表達ChR2 的神經元移植到HD 小鼠的無神經節區。顯微注射技術是將分化完成的細胞移植到HD 模式動物腸管的主要方法，而內窺鏡下的顯微注射技術會給受體提供一個更安全、有效的細胞移植方式。Cheng 等［24］發現在內窺鏡下進行顯微注射比直接進行開放性手術更節約時間，且被移植小鼠未出現并發癥。Cooper 等［15］則提出移植前的細胞準備程序是影響移植成功與否的重要一環，主要包括了檢驗移植細胞是否具有正常功能、是否能夠安全移植等流程。針對移植ENCDC 的效率，Zhao 等［25］團隊通過Y-27632 抑制ROCK 信號通路顯著加速了ENCDC 在體內外的生長和遷移。

1.3 施旺細胞 有研究表明，除了VNC 和SNC，施旺細胞前體也參與了腸道神經系統的形成，而膠質細胞源性神經營養因子（glial cell derived neurotrophie factor，GDNF）和內皮素3（endothelin 3，EDN3）則是起到了趨化引導腸道神經細胞在腸道內遷移定植的作用［26］。在腸道神經系統的發育過程被更多地研究背景下，Soret等［27］發現對HD 小鼠（HolTg/Tg、Ednrbs-l/s-l 以及雌性TashTTg/Tg）進行GDNF 灌腸，可以導致全結腸的內源性GDNF 和Ret 因子表達水平升高，促進神經元細胞的形成，全面改善結腸結構和功能。雖然對GDNF 誘導產生神經元細胞的機制了解尚不清楚，但是該研究發現有1/3 的新生神經元細胞來自外源性Dhh-Cre+施旺細胞。除此之外，研究者還發現以C57BL/6N 為遺傳背景的HD 小鼠（HolTg/Tg）與以FVB/N 為遺傳背景的HolTg/Tg小鼠相比，在進行GDNF 灌腸后會產生更為密集的腸道神經元細胞［28］。Pan 等［7］則利用細胞培養、活體細胞成像等研究成功完成了對在HD 患者無神經節腸段中定植表達PLP1 的施旺細胞的分離、擴增，再度證明了用施旺細胞誘導產生腸神經元細胞的可能性，為細胞治療的細胞來源增添了新的選擇。

2 問題與挑戰

2.1 治療效果 近幾年的研究發現，HD 患者不僅存在遠端腸道神經缺失的現象［29-30］，還有Cajal 間質細胞的缺乏、內在B 淋巴細胞缺陷［31］、腸道菌群紊亂［32］等其他腸道改變。而目前HD 患者的細胞治療策略主要針對的是遠端腸道無神經定植的問題，細胞治療能否同時矯治腸道神經缺乏之外的病變具有不確定性，因此細胞治療是否能完全恢復HD 患者的腸道功能便成了亟待回答的問題。雖然Bhave 等［33］通過移植ENCC 到HD 小鼠缺乏腸道神經的腸段可以顯著增加HD 小鼠的Cajal 間質細胞，解決HD 病變腸道Cajal 間質細胞缺乏的問題。但是Cajal 間質細胞數量的增加能否對HD 腸道蠕動功能的恢復提供幫助，相關研究仍然較少。同樣，細胞治療對HD 患者的免疫功能、腸道平滑肌功能等的影響作用也是不確定的。此外，細胞治療過程中是否可以產生足夠的腸道來源細胞，移植后是否可以發生有效的細胞遷移，使移植后的腸道神經細胞穩定定植在HD 病變腸段等問題，目前都有待進一步探索。

2.2 安全性評估 細胞癌變主要發生在利用PSC 分化ENCC 的過程中，由于是通過人工技術化生或維持PSC 的，這些細胞的生存條件很大程度地偏離了生物體內自然環境，更容易發生染色體畸變、拷貝數變異或單核苷酸變異等突變，這成為其惡變傾向的主要因素［6，34］。因此，研究者想要從臨床試驗中得到細胞治療是否會癌變的安全性評價，長時間的隨訪必不可少［6］。這種突變可在分化之前和分化之后發生，而分化之后發生的遺傳物質改變更容易被忽略［35］。除此之外，細胞療法的致癌性還可能與介導重新編碼的因子持續在PSC 中保持活性有關，這進一步提高了基因突變的概率［35］。例如，介導體細胞重新編碼為PSC 的逆轉錄因子c-Myc，正是最常見的癌變因子之一［9］。因此，安全性評估和如何有效控制細胞癌變是HD 細胞治療亟待解決的關鍵性課題之一。

2.3 倫理道德 雖然現在大部分細胞療法的細胞來源都是自體細胞，但是在臨床和科研的探索過程中，細胞療法大多使用的還是同種異體的細胞，這就可能導致倫理道德問題的發生［36］。此外，采用損傷人類胚胎的代價來換取對某個疾病的緩解，這個倫理問題仍一直困擾著各種細胞治療方案，這不僅僅是針對HD，也是導致近十年只有少數細胞療法能通過監管批準進入市場的原因［37］。

臨床試驗之前風險收益比評估也是一項必要的倫理評價指標［38］。在現有接受根治手術的HD 患者中，總體優良存活率≥95%［39-40］，這就引發了這樣一個問題：是否有必要在這些患者中開展首例人類細胞療法臨床試驗？Alhawaj 等［37］對此提出了一個臨床試驗設想：將存在造瘺高風險的長段型巨結腸患者作為先期試驗對象，將細胞治療作為根治手術的輔助治療方案，類似于晚期惡性腫瘤的術前化療方案，這部分患者將有可能在細胞療法試驗中獲益，減少腸造瘺概率，改善根治術前的生活質量，同時有望在試驗成功時治愈疾病無需手術。

3 總結與展望

雖然HD 的細胞治療仍處于起步階段，各類臨床研究和試驗還有很長的路要走，但是近十年的研究成果已經可以看到這一領域有著巨大的潛力，有望在未來可以推動臨床上HD 的非手術治療進展，不僅如此，細胞治療也在HD 的致病機制、模型構建［41］、藥物開發［42］等領域有著不可替代的地位。

與此同時，細胞治療在進入大眾視野之前，還需要經受許多考驗和挑戰：如何在進行臨床試驗和研究過程中不觸碰倫理道德底線，如何能夠在體外更精確地控制細胞分化，以及如何最大程度減少移植細胞的癌變等都是未來需要解決的難題。