2型糖尿病合并急性腦梗死患者血清miR-223-3p、miR-134-5p水平變化及其意義

唐旭軍，于曉鈞，莫偉強(qiáng)，陳絢，彭翠翠

1 梧州市紅十字會醫(yī)院急診科，廣西梧州543002；2 梧州市紅十字會醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

2型糖尿病（T2DM）若血糖長期得不到有效控制，將造成嚴(yán)重并發(fā)癥［1］。急性腦梗死（ACI）是常見的腦血管病變，經(jīng)規(guī)范化治療后仍有部分患者療效欠佳，預(yù)后不良［2］。有研究顯示，T2DM合并ACI對患者的認(rèn)知功能及生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，也是T2DM病死率增加的重要因素［3-4］。因此，加強(qiáng)T2DM合并ACI的早期監(jiān)測是臨床研究的重點(diǎn)。ACI神經(jīng)功能受損機(jī)制復(fù)雜，有研究表明氧化應(yīng)激與腦組織缺血缺氧損害關(guān)系密切［5］。微小核糖核酸（miR）在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色，可異常表達(dá)于糖氧剝奪神經(jīng)元或缺氧缺血腦組織中［6］。miR-223-3p和miR-134-5p為新發(fā)現(xiàn)的miR分子，研究顯示，miR-223-3p可抑制單核巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)及動脈粥樣硬化（AS）進(jìn)展，而AS是ACI的重要病理基礎(chǔ)［7］。miR-223-3p可作為T2DM發(fā)病前脂肪組織功能障礙的潛在生物標(biāo)志物［8］。miR-134-5p在缺氧缺血性腦損傷新生大鼠中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-134-5p可減輕新生大鼠腦組織損傷［9］。miR-134-5phai還可通過靶向Bcl-2促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡［10］。本研究觀察了T2DM合并ACI患者血清miR-223-3p、miR-134-5p水平變化，并分析其與氧化應(yīng)激損傷及預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年12月—2022年12月梧州市紅十字會醫(yī)院收治的T2DM合并ACI患者123例納入研究組，選擇同期入院的T2DM患者50例納入T2DM對照組，體檢健康者50例納入健康對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》［11］；②ACI診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》［12］；③ACI為首次發(fā)病；④年齡40 ～ 80歲；⑤ACI發(fā)病12 h內(nèi)入院；⑥病歷資料完整；⑦患者或家屬知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、肝、腎功能不全；②合并血液系統(tǒng)疾病；③合并急慢性感染；④近期有顱內(nèi)手術(shù)史或腦外傷史；⑤腦出血或血管畸形所致的神經(jīng)功能缺損；⑥妊娠期或哺乳期女性；⑦入組前已進(jìn)行溶栓或介入治療。研究組男78例、女45例，年齡40 ～80（63.49 ± 4.92）歲，T2DM病程（5.09 ± 1.12）年。T2DM對照組男30例、女20例，年齡41 ～ 78（62.87 ±4.74）歲，T2DM病程（4.33 ± 0.97）年。健康對照組男32例、女18例，年齡40～79（62.13 ± 5.61）歲。三組性別和年齡資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。本研究經(jīng)梧州市紅十字會醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2 血清miR-223-3p、miR-134-5p檢測 受試者入院后24 h內(nèi)采集各組空腹肘靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心5 min，分離血清。采用qRT-PCR檢測血清miR-223-3p、miR-134-5p。采用TRIzol法提取血樣本中的總RNA，測定濃度和純度；反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；將cDNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件包括預(yù)變性95 ℃ 60 s、變性95 ℃ 60 s、退火58 ℃ 30 s、延伸 72 ℃ 30 s，共36次循環(huán)。以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示miR-223-3p、miR-134-5p表達(dá)水平。U6上下游引物序列分別為5′-TGGAAGCTCGGCAATACCAG-3′，5′-CCTTTGCGTTCATGGGCATT-3′；miR-223-3p上下游引物序列分別為5′-CACACTTGGAAGCTGATTCAG-3′，5′-CTTCATCCAAATTGCGAGATGC-3′；miR-134-5p上下游引物序列分別為5′-CAAGTATGCTTGCTGAAGGAG-3′，5′-ACCTCGTAAGCGCATGAACAG-3′。

1.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 采用硫代巴比妥酸法檢測血清丙二醛（MDA），黃嘌呤氧化法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD），采用分光光度法檢測血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。

1.4 預(yù)后資料收集 研究組患者治療3個(gè)月后根據(jù)改良Rankin量表（mRS）評分判定預(yù)后情況。mRS評分0 ～ 1分為預(yù)后良好亞組，共91例；mRS評分2 ～ 6分為預(yù)后不良亞組，共32例［13］。收集兩亞組年齡、性別、吸煙史、入院時(shí)美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分（NIHSS）、高脂血癥史、高血壓史、血尿酸、糖化血紅蛋白（HbA1c）檢查資料。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。采用Logistic回歸模型分析T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的影響因素。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析各指標(biāo)對T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的預(yù)測效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miR-223-3p、miR-134-5p及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 見表1。

表1 三組血清miR-223-3p、miR-134-5p及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（）

表1 三組血清miR-223-3p、miR-134-5p及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（）

注：與健康對照組相比，*P＜0.05；與T2DM對照組相比，#P＜0.05。

組別研究組T2DM對照組健康對照組GSH-Px（U/L）44.68 ± 6.81*#58.72 ± 10.37*127.78 ± 12.29 n 123 50 50 miR-223-3p 0.57 ± 0.09*#0.97 ± 0.20*1.56 ± 0.37 miR-134-5p 2.14 ± 0.67*#1.61 ± 0.36*0.75 ± 0.15 MDA（mmol/L）16.50 ± 3.09*#12.60 ± 2.34*4.03 ± 0.51 SOD（U/L）95.00 ± 11.40*#126.53 ± 19.15*346.69 ± 81.13

2.2 T2DM合并ACI患者血清miR-223-3p、miR-134-5p與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的相關(guān)性 T2DM合并ACI患者血清miR-223-3p與SOD、GSH-Px呈正相關(guān)，與MDA呈負(fù)相關(guān)（r分別為0.454、0.513、-0.463，P均＜0.05）；血清miR-134-5p與MDA呈正相關(guān)，與SOD、GSH-Px呈負(fù)相關(guān)（r分別為0.562、-0.475、-0.507，P均＜0.05）。

2.3 T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的影響因素 預(yù)后良好亞組與預(yù)后不良亞組性別、吸煙史、高脂血癥史占比、血尿酸、HbA1c水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組年齡更高，入院時(shí)NIHSS評分、高血壓史占比、血清miR-134-5p及MDA水平升高，血清miR-223-3p、SOD、GSH-Px水平降低（P均＜0.05）。見表2 ～ 4。以T2DM合并ACI患者預(yù)后情況為因變量，以單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，建立非條件Logistic回歸模型。回歸過程采用逐步后退法，進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05。回歸分析結(jié)果顯示，入院時(shí)NIHSS評分偏高、miR-134-5p偏高、MDA偏高是T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，miR-223-3p偏高、SOD偏高、GSH-Px偏高為保護(hù)因素（P均＜0.05）。見表5。

表2 預(yù)后良好亞組與預(yù)后不良亞組性別、吸煙史、高血壓史、高脂血癥史比較［例（%）］

表3 預(yù)后良好亞組與預(yù)后不良亞組年齡、NIHSS評分、血尿酸、HbA1c水平比較（）

注：與預(yù)后良好亞組相比，*P＜0.05。

組別預(yù)后良好亞組預(yù)后不良亞組HbA1c（%）7.52 ± 1.34 8.01 ± 1.73 n 91 32年齡（歲）63.34 ± 4.61 66.76 ± 5.74*入院時(shí)NIHSS評分（分）2.78 ± 0.57 10.44 ± 2.12*血尿酸（μmol/L）395.23 ± 26.53 405.12 ± 27.94

表4 預(yù)后良好亞組與預(yù)后不良亞組血清miR-223-3p、miR-134-5p及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（）

表4 預(yù)后良好亞組與預(yù)后不良亞組血清miR-223-3p、miR-134-5p及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（）

注：與預(yù)后良好亞組相比，*P＜0.05。

組別預(yù)后良好亞組預(yù)后不良亞組GSH-Px（U/L）46.37 ± 8.11 39.87 ± 6.03*n 91 32 miR-223-3p 0.66 ± 0.14 0.31 ± 0.06*miR-134-5p 1.87 ± 0.45 2.91 ± 0.69*MDA（mmol/L）15.40 ± 2.17 19.63 ± 3.46*SOD（U/L）98.16 ± 13.39 86.01 ± 10.20*

表5 T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的影響因素分析結(jié)果

2.4 血清miR-223-3p、miR-134-5p對T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的預(yù)測效能 血清miR-223-3p、miR-134-5p兩指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，ROC曲線下面積（AUC）分別為0.728、0.739、0.862，其中聯(lián)合應(yīng)用診斷效能最高。見表6、OSID碼圖1。

表6 血清miR-223-3p、miR-134-5p對T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值

3 討論

研究表明，T2DM和ACI之間存在著密切聯(lián)系，糖尿病為ACI危險(xiǎn)因素之一。血糖波動可使T2DM患者體內(nèi)氧化應(yīng)激過度激活，導(dǎo)致其血管內(nèi)膜增厚，進(jìn)一步誘發(fā)ACI［14］。因此，早期識別和篩查有助于早期制定個(gè)性化綜合干預(yù)措施，降低并發(fā)ACI的風(fēng)險(xiǎn)。

研究表明，在ACI發(fā)生發(fā)展過程中，缺血缺氧可引起多種miR水平變化［15］。miR-223-3p和miR-134-5p是近些年頗受關(guān)注的miR分子。有研究顯示，miR-223-3p在AS患者外周血及主動脈斑塊中表達(dá)降低，上調(diào)miR-223-3p可減弱促炎巨噬細(xì)胞活性以及機(jī)體炎癥反應(yīng)［7］。糖尿病腎病患者血漿miR-223-3p水平降低［16］，上調(diào)miR-223-3p表達(dá)可減輕高糖所致的小鼠足細(xì)胞損傷，并可減少足細(xì)胞過氧化產(chǎn)物MDA水平［17］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-134-5p在血管癡呆大鼠皮層中表達(dá)明顯增加，miR-134-5p可通過損傷皮質(zhì)神經(jīng)元及降低突觸蛋白表達(dá)量，加重大鼠認(rèn)知功能障礙［18］。還有研究顯示，miR-134-5p高表達(dá)與腦卒中復(fù)發(fā)、心肌梗死的發(fā)病存在明顯聯(lián)系；與穩(wěn)定斑塊相比，頸動脈不穩(wěn)定斑塊中miR-134-5p水平更高［19-20］。本研究結(jié)果顯示，T2DM并發(fā)ACI患者血清miR-223-3p水平降低、miR-134-5p水平增高，與相關(guān)研究結(jié)果基本一致［19-20］，提示miR-223-3p、miR-134-5p可能參與T2DM并發(fā)ACI的發(fā)病。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致T2DM患者并發(fā)ACI及患者預(yù)后不良的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有研究認(rèn)為，糖耐量異常或合并T2DM的腦梗死患者體內(nèi)氧化應(yīng)激更為嚴(yán)重［21］。ACI發(fā)生時(shí)，腦組織處于缺血缺氧狀態(tài)，此時(shí)氧自由基生成增多、清除減少，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，造成組織損傷［22］。本研究中，T2DM并發(fā)ACI患者血清MDA水平升高，SOD、GSH-Px降低，提示患者體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激損傷。Pearson檢驗(yàn)結(jié)果顯示，T2DM合并ACI患者血清miR-223-3p與SOD、GSH-Px呈正相關(guān)，與MDA呈負(fù)相關(guān)，而血清miR-134-5p與MDA呈正相關(guān)，與SOD、GSH-Px呈負(fù)相關(guān)，這提示T2DM并發(fā)ACI過程中miR-223-3p表達(dá)減少及miR-134-5p增加可能與氧化應(yīng)激的過度激活有關(guān)。

T2DM合并ACI患者遺留神經(jīng)功能損害將對其日常生活產(chǎn)生不利影響。本研究分析了miR-223-3p、miR-134-5p與患者預(yù)后不良的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-134-5p、MDA偏高是T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，miR-223-3p、SOD、GSH-Px偏高為其保護(hù)性因素。究其原因：①miR-223-3p在T2DM并發(fā)ACI患者中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-223-3p可抑制氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能的作用，故miR-223-3p水平越低者，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)越大；②miR-134-5p水平升高可增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡，造成細(xì)胞損傷，引起神經(jīng)功能障礙，致其預(yù)后不良［23］。此外，入院時(shí)NIHSS評分也是T2DM合并ACI患者預(yù)后不良的影響因子。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-223-3p聯(lián)合miR-134-5p預(yù)測預(yù)后不良的AUC值達(dá)0.862，提示預(yù)測效能較好。T2DM患者并發(fā)ACI后及時(shí)檢測miR-223-3p、miR-134-5p水平有助于早期篩查預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)患者。

綜上所述，T2DM合并ACI患者血清miR-223-3p水平降低、miR-134-5p水平增高，其表達(dá)水平與患者氧化應(yīng)激損傷及預(yù)后關(guān)系密切，miR-223-3p聯(lián)合miR-134-5p對于患者短期預(yù)后的預(yù)測價(jià)值較高。