SLC5A8基因過表達的炎癥性腸病細胞模型結構及IL-8、TGF-β1表達變化觀察

趙澤滿，吳育朔，劉雅涵，矯政洧，蔡思源，靳小石

1 河北大學臨床醫(yī)學院，河北保定071000；2 河北大學附屬醫(yī)院普通外科；3 河北大學附屬醫(yī)院門診部

炎癥性腸病（IBD）是一種以慢性、復發(fā)性腸道炎癥為特征的疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎，可累及腸道的任何部分，臨床上常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、血便、體質量減輕等，還會導致嚴重并發(fā)癥［1］。SLC5A8基因作為被發(fā)現(xiàn)的SLC5基因家族中的第8個成員，其編碼的蛋白是與鈉離子耦聯(lián)轉運短鏈脂肪酸（SCFAs）高親和力轉運體，在結腸、回腸中大量表達［2］。SCFAs能通過SLC5A8調控的轉運蛋白進入結腸上皮細胞內，參與免疫調節(jié)，因此推測SLC5A8可能通過免疫調控參與了IBD的發(fā)生。2022年1—10月，本研究觀察了SLC5A8基因過表達后，脂多糖誘導的IBD細胞模型結構及IL-8、TGF-β1水平變化，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要材料 人正常結腸上皮細胞FHC由某附屬醫(yī)院中心實驗室饋贈，置于含10%胎牛血清+1%青—鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期細胞進行實驗。脂多糖購自北京索萊寶科技有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基、青—鏈霉素溶液購自大連美侖生物技術有限公司，TRIzol Universal總RNA提取試劑購自TIANGEN公司，HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）購自南京諾唯贊生物科技有限公司，RT-qPCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司，SLC5A8過表達質粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，Human IL-8 ELISA Kit、Human/Mouse/Rat TGF-β1ELISA Kit購自聯(lián)科生物技術有限公司。實時熒光定量PCR儀為Applied Biosystems公司產品。

1.2 細胞分組與模型制作 將FHC細胞分為對照組、模型組及實驗組。對照組轉染pcDNA3.1-GFP空載質粒；模型組轉染pcDNA3.1-GFP空載質粒，再加100 μg/mL脂多糖刺激24 h；實驗組轉染SLC5A8基因過表達質粒，再加100 μg/mL脂多糖刺激24 h。

1.3 細胞結構觀察 棄去細胞上清液，剩余細胞用PBS清洗（2 mL），重復2次；用電鏡固定液固定細胞，保存于4 ℃冰箱，透射電鏡下觀察三組細胞結構。

1.4 細胞及培養(yǎng)液上清中IL-8、TGF-β1檢測 提取各組FHC細胞總RNA并反轉錄為cDNA，采用RT-qPCR法檢測IL-8、TGF-β1mRNA。以TBP作為內參。TBP上游引物序列為5′-TGTATCCACAGTGAATCTTGGTTG-3′，下游引物序列為5′-GGTTCGTGGCTCTCTTATCCTC-3′；IL-8基因上游引物序列為5′-GAGAGTGATTGAGAGTGGACCAC-3′，下游引物序列為5′-CACAACCCTCTGCACCCAGTTT-3′；TGF-β1基因上游引物序列為5′-TACCTGAACCCGTGTTGCTCTC-3′，下游引物序列為5′-GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA-3′。PCR 反應條件：預變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 3～10 s，60 ℃ 10～30 s，共40個循環(huán)；溶解95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以2－ΔΔCt表示目的基因相對表達量。取細胞上清液入離心管，離心機離心（2 600 r/min，10 min）去除沉淀物。采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液上清中的IL-8、TGF-β1，按試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism9.4軟件作圖。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用最小顯著性差異法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞結構改變 對照組細胞膜表面微絨毛無斷裂，無脫落，緊密連接結構致密呈帶狀；模型組細胞膜表面微絨毛變稀疏，脫落，緊密連接的細胞間隙增寬；實驗組細胞膜表面存在微絨毛脫落，緊密連接結構部分破壞。見圖1。

圖1 各組細胞結構變化

2.2 各組細胞及培養(yǎng)液上清中IL-8、TGF-β1表達比較 與對照組相比，模型組IL-8 mRNA表達及培養(yǎng)液上清中IL-8水平升高，TGF-β1mRNA表達及培養(yǎng)液上清中TGF-β1水平降低（P均＜0.01）；與模型組相比，實驗組IL-8 mRNA表達及培養(yǎng)液上清中IL-8水平降低，TGF-β1mRNA表達及培養(yǎng)液上清中TGF-β1水平升高（P均＜0.01）。見表1。

表1 各組細胞及培養(yǎng)液上清中IL-8、TGF-β1表達比較（）

表1 各組細胞及培養(yǎng)液上清中IL-8、TGF-β1表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.01。

組別實驗組模型組對照組TGF-β1 1.21 ± 0.05#0.30 ± 0.04*1.00 ± 0.03 IL-8 mRNA 1.20 ± 0.10#2.46 ± 0.13*1.00 ± 0.05 IL-8 0.70 ± 0.01#2.29 ± 0.00*1.00 ± 0.01 TGF-β1 mRNA 1.40 ± 0.11#0.72 ± 0.06*1.00 ± 0.05

3 討論

調查顯示，IBD發(fā)病率在世界范圍內呈持續(xù)增高趨勢［3］。IBD發(fā)病機制復雜，病因仍不十分清楚，所以需要對IBD機制做更加深入的研究。SIVAPRAKASAM等［4］的研究顯示，IBD是由于宿主免疫系統(tǒng)和微生物群之間的共生關系被破壞而導致腸道慢性炎癥，各種因素會改變腸道微生物群，導致腸道菌群生態(tài)失調，其中以飲食和膳食纖維兩個因素較為關鍵。

SLC5A8可通過影響?zhàn)つっ庖呦到y(tǒng)的耐受反應從而調節(jié)腸道穩(wěn)定。有研究表明，SLC5A8基因通過影響結腸組織與腸系膜淋巴結中的CD4+T淋巴細胞來調節(jié)機體免疫［5］。CD4+T淋巴細胞可通過分泌IL-10、IL-8及IL-12等因子影響IBD的發(fā)生和發(fā)展［6-7］。SLC5A8基因的表達產物是Na+-單羧酸偶聯(lián)轉運蛋白，其主要功能將細菌發(fā)酵的短鏈脂肪酸（SCFA）轉運到細胞內發(fā)揮作用。Na+-單羧酸偶聯(lián)轉運蛋白在腸道黏膜組織、尤其是在丁酸含量較高的結腸黏膜組織中含量最多。SCFA主要是由細菌在結腸中發(fā)酵膳食纖維并產生，主要包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，它們不僅可以作為結腸細胞能量來源，還具有抑制免疫細胞活化的功能，其中以丁酸鹽的抗炎效果最為明顯［8-10］。丁酸可以通過SLC5A8轉運體進入細胞，然后通過促進抗炎因子表達及抑制促炎因子表達發(fā)揮抗炎作用［11］。IBD患者由于腸道環(huán)境失調，影響了丁酸的產生、氧化和吸收［12］。本研究實驗組利用脂多糖構建IBD細胞模型后，再轉染過表達SLC5A8質粒，發(fā)現(xiàn)炎癥因子表達呈下降趨勢，抗炎因子表達呈上升趨勢。因此，我們推測SLC5A8基因可能參與抑制IBD的發(fā)生發(fā)展。

腸道黏膜損傷是IBD患者的主要特征之一，所以促進腸道黏膜愈合可能成為減輕IBD患者臨床癥狀、抑制疾病復發(fā)的新方向［13］。腸道黏膜損傷的出現(xiàn)預示著腸上皮屏障破壞。腸黏膜愈合是由上皮細胞增殖和分化完成的，巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等免疫細胞共同參與調節(jié)［14］。本研究透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組與模型組相比，細胞膜表面微絨毛脫落減少，緊密連接結構破壞較少。可以推測出SLC5A8基因可能通過維持腸道黏膜的完整性，保護IBD腸道黏膜。

IL-8作為一種促炎細胞因子，通過介導多種信號通路，在許多炎癥性疾病包括IBD中發(fā)揮著重要作用，同時也參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展［15-16］。WALANA等［17］應用IL-8拮抗劑G31P治療DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠模型，顯著減低了血清IL-8水平，上調緊密連接蛋白表達，抑制了炎癥的發(fā)展，減輕了結腸纖維化。本研究結果顯示，實驗組細胞中IL-8 mRNA表達及培養(yǎng)液上清中IL-8水平低于模型組，推測SLC5A8基因可能通過抑制IL-8的表達來干預IBD。

人體腸黏膜系統(tǒng)中存在著多種的免疫細胞亞群，其活性受到細胞因子調節(jié)，其中包括TGF-β1［18］。TGF-β1是一種由多種類型細胞產生的具有多重效應的細胞因子，可控制腸黏膜免疫細胞和非免疫細胞的活化、生長、增殖和分化。TGF-β1可促進調節(jié)性T細胞、輔助性T細胞（Th）17和Th9分化的能力，從而在一些炎癥性疾病中發(fā)揮作用［19］。炎癥T淋巴細胞及其相關促炎細胞的積累是IBD患者的顯著特征之一，與IBD的發(fā)生發(fā)展密切相關［20］。本研究中實驗組細胞TGF-β1mRNA表達及培養(yǎng)液上清TGF-β1水平上調，提示SLC5A8基因干預IBD的機制可能還與上調TGF-β1分泌、進一步影響T細胞免疫有關。

綜上所述，SLC5A8基因過表達有助于維持IBD細胞模型的結構，抑制炎癥細胞因子IL-8表達，促進抗炎細胞因子TGF-β1表達，從而有助于減輕IBD的炎癥反應。以上研究結果為IBD的治療提供了新的思路及實驗依據。