小檗堿通過靶向Akt 激酶發揮抗癌作用的研究進展

劉代利 王 智 李 玲 張競飛 秦 漢 蔡 圳

1.濱州醫學院口腔醫學院，山東煙臺 264000；2.山東省臨沂市人民醫院口腔科，山東臨沂 276000

癌癥是最常見的疾病類型，也是導致人類死亡的主要原因[1]。癌癥的發生、發展涉及諸多信號通路和關鍵蛋白，其中Akt 激酶在很多通路中發揮關鍵調控作用。Akt 激酶是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，能被多種刺激和激酶激活，參與活化多種蛋白底物，通過調節細胞生存、增殖、凋亡、侵襲和血管生成調控癌癥的發生、發展[2]。作為腫瘤治療的靶點，Akt 激酶在藥物抗癌領域被廣泛研究。小檗堿（berberine，BBR）是一種來源于天然植物的季銨生物堿。研究發現，BBR 可通過靶向Akt 激酶在調控腫瘤細胞增殖和轉移[3]、誘導細胞凋亡和自噬[4]及腫瘤耐藥[5]等方面發揮作用，有望開發為一種理想的抗癌藥物，本文就BBR 靶向Akt 激酶的抗癌機制做一綜述，旨在為BBR 抗腫瘤研究提供一定的思路和參考。

1 BBR 的生物學功能

近年來，藥用植物及其活性化合物的抗癌功效已受到廣泛關注。BBR 別名黃連素，味苦，主要存在于黃連、黃柏和三顆針等多種中草藥的根、莖、皮中，其分子式為[C20H18NO4]+。見圖1。BBR 具有廣泛的藥理活性，包括抗感染、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、止瀉及成骨等[6]。中醫常將黃連素用于清熱解毒和治療腹瀉，目前臨床上也廣泛將其用于治療胃腸炎和痢疾。BBR 的抗癌作用已在體內和體外實驗中得到廣泛研究，近年來體外研究發現，BBR 能夠有效抑制肝癌[7]、喉癌[8]和子宮內膜癌[9]等的發展。另外，在動物模型中研究發現，BBR 能夠顯著減緩體內腫瘤生長速度，減小腫瘤體積[10-13]。以上研究表明，BBR 具有廣譜抗腫瘤特性，可作為治療不同癌癥的候選藥物。本文所涉及的BBR 抗癌作用機制見圖2。

圖1 小檗堿的化學結構

圖2 小檗堿靶向Akt 激酶的抗癌機制

2 BBR 通過靶向Akt 激酶發揮抗癌作用

2.1 BBR 通過靶向Akt 激酶調控細胞周期

細胞周期調控機制失調會導致癌細胞過度增殖，細胞周期檢查點受細胞周期蛋白及細胞周期蛋白依賴性激酶的嚴格調控，保證細胞周期有序進行。

BBR 通過下調人肝癌細胞內p-Akt 激酶和S 期激酶相關蛋白2 的表達，增強叉頭框蛋白O3a 的表達和核轉移，進而提高細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21Cip1 和p27Kip1 轉錄的mRNA 數量及翻譯后蛋白的穩定性，促使肝癌細胞周期阻滯在G0/G1期[14]。在BBR 對乳腺癌[15]和甲狀腺癌[16]的研究中也得到了類似的發現。此外，BBR 可通過作用Akt 激酶不同的上游調控因子發揮作用。例如，BBR 可抑制PI3K/Akt 通路的上游正調控因子胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白3 的轉錄，誘導G0/G1期阻滯，抑制結直腸癌細胞增殖[17]。BBR 也能通過加速表皮生長因子受體-調蛋白的降解，介導細胞周期蛋白D1 積累，導致卵巢癌細胞周期阻滯[18]。

總結以上研究發現，不論是BBR 對Akt 激酶上游調控因子還是對Akt 激酶的直接作用，BBR 都是通過抑制PI3K/Akt 通路發揮對癌細胞的周期阻滯作用。Eo 等[19]發現，BBR 能夠促進人軟骨肉瘤細胞中Akt 激酶的磷酸化，增強p53 和p21 的表達，從而降低細胞周期蛋白B1 水平，導致細胞周期阻滯在G2/M期。結合上述研究，推測BBR 可能通過對Akt 激酶的雙向調控介導癌細胞周期阻滯。

2.2 BBR 通過靶向Akt 激酶誘導線粒體凋亡和自噬導致細胞死亡

線粒體凋亡是細胞凋亡的主要途徑之一，涉及Bcl-2 家族蛋白表達的失調、線粒體膜電位的下降、細胞色素C 的釋放及胱天蛋白酶的激活等過程。在人甲狀腺癌細胞中，BBR 能夠通過抑制Akt 激酶表達，上調促凋亡蛋白和下調抗凋亡蛋白Bcl-2，激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和活化胱天蛋白酶-3，介導線粒體凋亡途徑[16]。在骨肉瘤細胞[20]和胃癌細胞[13]中的研究也得到了類似的結果。此外，BBR 可通過作用于肝癌細胞促進胞內活性氧積累，激活PH 結構域富含亮氨酸重復蛋白磷酸酶2，介導Akt 激酶失活，促進哺乳動物不育系20 樣激酶磷酸化，靶向Jun 激酶，啟動線粒體凋亡途徑，最終導致細胞死亡[21]。

自噬是一種保守的自降解系統，對維持細胞內穩態至關重要。雖然自噬在癌癥中的作用尚有爭議，但多數研究將其介紹為一種抗腫瘤機制。BBR 對癌細胞自噬具有雙向調節作用。一方面，BBR 能夠通過抑制Akt 激酶活性誘導自噬導致癌細胞死亡。例如，BBR能夠通過抑制肝癌細胞中的Akt 激酶活性，降低其下游效應因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表達，激活自噬，導致細胞死亡[4]。與此同時，在黑色素瘤細胞[22]和急性淋巴細胞白血病細胞[12]中，BBR 也通過抑制Akt 激酶活性，激活自噬，誘導細胞死亡。另一方面，BBR 能夠通過抑制自噬，提高化療藥物的細胞毒性。BBR 通過調控乳腺癌細胞中磷酸酶與張力蛋白同源物的表達，增加Akt 激酶和mTOR 磷酸化水平，從而阻斷微管相關蛋白1 輕鏈3-Ⅱ的產生，促進p62 的細胞積累，抑制自噬，逆轉阿霉素耐藥[11]。

以上研究表明，與抑制Akt 激酶活性促進線粒體凋亡不同，BBR 在調節自噬方面的作用復雜且富有爭議。首先，BBR 在不同腫瘤中對Akt 激酶的調節作用不同。BBR 既可以抑制Akt 激酶活性，又能夠促進其磷酸化，推測可能與BBR 作用靶點的多樣性、濃度或腫瘤的類型有關。其次，自噬在腫瘤中的作用也不甚明確，激活自噬可以誘導癌細胞自噬性死亡，而抑制自噬可以抵抗自噬介導的耐藥，增強化療藥物藥效。總結以上研究發現，盡管BBR 靶向Akt 激酶可抑制各種癌細胞，但在細胞周期阻滯和誘導細胞死亡方面的機制仍需進一步研究。

2.3 BBR 通過靶向Akt 激酶抑制癌細胞轉移

癌細胞向遠處器官擴散的能力決定了腫瘤的惡性程度，大部分與癌癥相關的死亡是由癌癥轉移造成的。上皮間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是一種進化上保守的發育程序，驅動上皮細胞轉變為間質細胞，增強癌細胞的侵襲性和耐藥性。黑色素瘤細胞經BBR 處理后，EMT 受到抑制，表現為視黃酸受體表達失調，上皮鈣黏素上調，神經鈣黏素下調，進一步研究發現，黑色素瘤細胞中p-PI3K和p-Akt 激酶表達下降，提示BBR 通過PI3K/Akt 通路抑制黑色素瘤細胞遷移和侵襲[23]。另外，BBR 還可以通過作用Akt 激酶及其他通路共同抑制癌細胞轉移。例如，Kuo 等[24]發現，BBR 可通過調節Akt 激酶的mRNA 表達和蛋白降解，下調Akt 激酶蛋白水平，阻止乳腺癌細胞中核因子κB 和Jun 激酶的激活，降低基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2 和MMP-9 表達水平。與之相似，BBR 能與乳腺癌細胞中肝細胞配體B2 靶向結合，抑制血管內皮生長因子受體2 及其下游信號成員Akt 激酶和細胞外調節蛋白激酶1/2 磷酸化，最終導致MMP-2 和MMP-9 表達下調[25]。

新生的微血管是腫瘤發生浸潤和轉移的第一站，抗血管生成是一種經典的抗癌方法，BBR 能夠通過靶向血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），避免新血管形成，抑制腫瘤浸潤和轉移。研究發現，BBR 作用于腫瘤啟動子組織多肽抗原誘導的乳腺癌細胞會下調VEGF 和纖維連接蛋白水平。細胞經PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 處理后，出現與BBR 對組織多肽抗原誘導的乳腺癌細胞具有相似的抑制作用，推測BBR 可通過抑制乳腺癌細胞PI3K/Akt 激酶通路抑制組織多肽抗原誘導的VEGF和纖維連接蛋白表達[26]。值得一提的是，肺癌細胞中PI3K/Akt 通路的激活可以促進內皮細胞管的形成和存活，從而改變微環境，利于腫瘤生長[27]。

2.4 BBR 通過靶向Akt 激酶提高化療藥物敏感性

化療是癌癥常用的治療方法，但耐藥機制嚴重影響其效果。多藥物聯合使用能夠顯著提高藥物敏感性和安全性。研究發現，順鉑和BBR 聯合治療可顯著降低順鉑耐藥胃癌細胞中p-PI3K、p-Akt 激酶和p-mTOR的表達，增加腫瘤組織中TUNEL 陽性細胞，減少Ki-67 陽性細胞[5]。推測BBR 可通過抑制順鉑耐藥胃癌細胞中的PI3K/Akt 通路抑制順鉑耐藥胃癌細胞的增殖并誘導DNA 損傷。此外，BBR 作用于順鉑耐藥卵巢癌細胞，抑制miR-93 的表達，上調PTEN 蛋白水平，進而對Akt 激酶的活化進行負調節，誘導細胞凋亡和周期阻滯[28]，即BBR 通過miR-93/PTEN/Akt 通路增加順鉑敏感性。實驗發現，BBR 和吉西他濱共同處理能夠顯著降低膀胱癌細胞中p-PI3K、p-Akt 激酶和Rad51 的表達[10]。提示BBR 通過抑制PI3K/Akt 通路下調Rad51 表達，增強吉西他濱誘導的細胞毒性。綜上所述，BBR 與化療藥物合用不僅可以增強其細胞毒性，而且對已產生耐藥性的癌細胞，BBR 仍可通過靶向Akt 激酶發揮抗癌作用，甚至逆轉癌細胞的耐藥性。

2.5 BBR 通過靶向Akt 激酶逆轉瓦爾堡效應和改善腫瘤微環境

瓦爾堡效應即有氧糖酵解，是指在氧氣充足的條件下，癌細胞傾向于將葡萄糖轉化為乳酸的代謝特征，能夠增強癌細胞的侵襲性和耐藥性，促進腫瘤進展。BBR 作用于肝癌細胞和乳腺癌細胞，抑制Akt/mTOR通路，進一步實驗發現，BBR 能夠增強癌細胞中葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）和泛素結合門合酶9 的結合，同時阻礙GLUT1 與Gα-相互作用蛋白C 端的相互作用，導致GLUT1 降解加快，葡萄糖攝入減少，逆轉了瓦爾堡效應[29]。在口腔癌細胞中，BBR 可降低Akt 激酶磷酸化總量，進一步研究發現，BBR 降低環氧化酶-2 的表達并減少了前列腺素E2的產生，調控口腔癌細胞凋亡[30]。由此可見，BBR 可能通過調控癌細胞代謝，調控炎癥因子釋放，改善TME，增強腫瘤免疫發揮抗癌作用。

3 總結與展望

癌癥是一個重大的全球健康問題，也是導致死亡的主要原因。傳統中藥在抗癌方面具有多途徑、多靶點、副作用小及成本低等優勢。《名醫別錄》中記載黃連：“微寒，無毒。主治五臟冷熱，久下泄澼、膿血，止消渴、大驚，除水，利骨，調胃，厚腸，益膽，治口瘡。”BBR作為黃連中的主要活性成分，盡管在Akt 激酶誘導的周期阻滯和自噬等方面作用機制尚有爭議，但仍可以通過靶向Akt 激酶介導多種抗癌作用，推測Akt 激酶是其作用的主要靶點之一，有望開發用于臨床癌癥治療。但由于BBR 抗癌作用途徑廣泛，對在BBR 影響下Akt 激酶和其他靶點的相互作用及這種效應是否會介導毒副作用仍值得深入闡釋。與一線抗癌藥物比較，雖然BBR 對某些癌癥細胞株的作用濃度大于100 μmol/L，但對多數腫瘤仍具有明顯的抑制作用。更需要臨床中注意的是，由于BBR 自身結構的不穩定，加之其可被外排轉運體排出的特性，導致其難以吸收入血發揮作用，如何使用合適的載體或結構改造使其克服這些缺點，提高BBR 的生物利用度，在腫瘤部位維持較高的藥物濃度以達到治療要求可能是未來BBR 在抗癌領域的研究方向。