過敏性鼻炎患兒血清miR-124-3p 和GATA3表達水平與疾病嚴重程度、Th1/ Th2 平衡的關系

陳玉卿 莊潔蓮 姜善雨

江蘇省無錫市婦幼保健院兒童保健耳鼻喉科，江蘇無錫 214002

兒童過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又稱變應性鼻炎，是兒童主要的呼吸道炎癥疾病，主要臨床表現為鼻癢、鼻塞、打噴嚏及頭痛等癥狀，對兒童的生活質量造成很大影響[1-2]。目前關于AR 的發病機制尚未明確，多數研究認為與Ⅱ型輔助性T 細胞[typeⅠhelper T cell，Th1）/Ⅱ型輔助性T 細胞（type Ⅱhelper T cell，Th2）免疫失衡有關，糾正Th1/Th2 免疫失衡是防治AR 的關鍵[3]。微RNA（microRNA，miRNA）參與機體免疫炎癥反應調節，作為疾病診斷與病情評估的分子標志物[4]。微RNA-124-3p（miR-124-3p）是一種重要的miRNA 之一，研究顯示，miR-124-3p 與腫瘤發生、病毒感染、炎癥反應等多種病理過程有關[5-6]。Hou 等[7]通過分析異丙托溴銨治療AR 小鼠后miRNAs表達譜發現，miR-124-3p 表達水平顯著升高，提示miR-124-3p 與AR 小鼠鼻黏膜過敏性免疫相關。GATA 結合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）是一種轉錄因子，調控原初性T 細胞向Ⅱ分化，Th2 細胞在AR 中起著重要作用[8]。研究顯示，使用攜帶miR-466a-3p 的慢病毒治療AR 小鼠，miR-466a-3p可負調節GATA-3 表達，減輕小鼠AR 癥狀[9]。經生物信息學分析顯示，miR-124-3p 與GATA3 有靶向結合位點，推測二者共同參與AR 的發生，本研究探討AR患兒血清miR-124-3p、GATA3 表達與患兒疾病嚴重程度、Th1/Th2 平衡的相關性，為AR 的防治提供理論支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年6 月至2022 年4 月在江蘇省無錫市婦幼保健院（以下簡稱“我院”）兒童保健耳鼻喉科確診的AR 患兒87 例為觀察對象（AR 組），其中男42 例，女45 例；年齡3～12 歲，平均（7.40±2.35）歲。按癥狀嚴重程度[10]分為輕度組53 例，中重度組34例。另選取同期在我院健康體檢兒童85 名為對照組，其中男45 名，女40 名；年齡3～13 歲，平均（7.20±2.40）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：①符合2019 年《兒童過敏性鼻炎診療——臨床實踐指南》[10]中的診斷標準，其中輕度AR 為對睡眠、學習等生活質量未產生明顯影響，中重度AR 表現為癥狀較重或對生活質量產生影響；②臨床資料完整；③所有患兒家長或監護人知情并同意。排除標準：①合并哮喘、肺結核等呼吸道疾??；②合并免疫系統疾病或其他慢性炎癥性疾??；③近期使用免疫抑制劑；④肝腎功能不全。本研究獲得我院醫學研究倫理委員會的審核并批準（2022-01-0302-03）。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及保存 采集AR 患兒確診24 h 內及對照組兒童體檢當日清晨空腹靜脈血5 ml 各兩份，其中一份3 000 r/min（離心半徑15 cm），離心15 min，收集上清，置于-80℃冰箱保存備用。另一份加入淋巴細胞分離液，分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），檢測Th1/Th2。

1.2.2 血清miR-124-3p 檢測 采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測血清miR-124-3p 水平，RNA 提取試劑盒（德國Qiagen）提取血清的總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA 濃度及純度，取2 μg 的RNA 使用miScript Reverse Transcription kit（德國Qiagen）反轉錄成cDNA，于-20℃冰箱保存。使用RT-PCR 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行PCR 擴增，反應體系為50 μl，其中10×PCR Buffer 5 μl，dNTPs 1 μl，正反向引物各1 μl，DNA模板2 μl，Tap 酶0.5μl，加雙蒸水至50μl。反應條件：95℃10min，38 個循環，94℃30 s，60℃30 s，70℃30 s。引物購自上海生物工程技術公司，miR-124-3p 正向引物（5’-3’）：CGACGTAAGGCACGCG；反向引物（5’-3’）：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT；U6 正向引物（5’-3’）：CGAGCACAGAATCGCTTCA；反向引物（5’-3’）：CTCGCTTCGGCAGCACATAT。以U6 作為內參，采用2-△△Ct分析miR-124-3p 表達水平。

1.2.3 流式細胞術檢測Th1/Th2 外周血經密度梯度離心分離PBMCs，分別加入PE/Cy5 表示的-CD3 抗體和FITC 標記的CD8 抗體孵育20 min，經裂解，破膜后，分別加入PE 標記的γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、PE 標記的白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）抗體標記細胞，抗體購自美國BD 公司，采用FACS 型流式細胞儀檢測，以IFN-γ、IL-4 表示Th1、Th2 細胞比例，并計算Th1/Th2。

1.2.4 其他指標檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測血清IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10、GATA3 水平，IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10 檢測試劑盒均購自Abcam公司，GATA3 檢測試劑盒購自武漢楚銳科藥業科技有限公司，嚴格按照相應試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，采用t 檢驗。計數資料以例數或百分比表示，采用χ2檢驗。AR 患兒血清miR-124-3p 表達與GATA3 相關性、miR-124-3p、GATA3 與Th1/Th2 及細胞因子相關性采用Pearson 法分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-124-3p、GATA3 水平比較

AR 組血清miR-124-3p 表達水平低于對照組，GATA3 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；中重度組血清miR-124-3p 表達水平低于輕度組，GATA3 水平高于輕度組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清miR-124-3p、GATA3 水平比較（）

表1 兩組血清miR-124-3p、GATA3 水平比較（）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與輕度組比較，bP＜0.05。MiR-124-3p：微RNA-124-3p；GATA3：GATA 結合蛋白3；AR：過敏性鼻炎。

2.2 AR 組與對照組外周血Th1、Th2 細胞比例及Th1/Th2 比較

AR 組Th1 細胞比例和Th1/Th2 比值低于對照組，Th2 細胞比例高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 AR 組與對照組外周血Th1、Th2 細胞比例及Th1/Th2 比較（）

表2 AR 組與對照組外周血Th1、Th2 細胞比例及Th1/Th2 比較（）

注AR：過敏性鼻炎；Th：輔助性T 細胞。

2.3 AR 組與對照組Th1、Th2 細胞因子水平比較

AR 組血清IFN-γ、IL-12 水平低于對照組，IL-4、IL-5、IL-10 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 AR 組與對照組Th1 與Th2 細胞因子水平比較（ng/L，）

表3 AR 組與對照組Th1 與Th2 細胞因子水平比較（ng/L，）

注AR：過敏性鼻炎；IFN-γ：γ 干擾素；IL：白細胞介素。

2.4 AR 患兒miR-124-3p、GATA3 水平相關性

相關性分析顯示，AR 患兒血清miR-124-3p 表達水平與GATA3 水平呈負相關（r=-0.495，P＜0.05），見圖1。經starbase 分析顯示，miR-124-3p 與GATA3有靶向結合位點，見圖2。

圖1 AR 患兒miR-124-3p、GATA3 水平相關性

圖2 miR-124-3p 與GATA3 靶向結合位點

2.5 AR 患兒miR-124-3p、GATA3 表達與Th1/Th2及細胞因子相關性分析

相關性分析顯示，miR-124-3p 與Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12 呈正相關（r＞0，P＜0.05），與Th2、IL-4、IL-5、IL-10 呈負相關（r＜0，P＜0.05）；GATA3 與Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12 呈負相關（r＜0，P＜0.05），與Th2、IL-4、IL-5、IL-10 呈正相關（r＞0，P＜0.05）。見表4。

表4 AR 患兒中miR-124-3p、GATA3 表達與Th1/Th2及細胞因子相關性分析

3 討論

AR 患兒的過敏癥狀易與普通感冒混淆，不能得到及時、規范治療，且患兒往往伴有哮喘、結膜炎等多類疾病，給兒童生活造成很大困擾，研究認為AR 的發病機制與Th1 和Th2 細胞免疫失衡有關[11-12]。

miRNA 通過對靶基因的調控參與多種疾病的病理過程[13]。miR-124-3p 是miRNA 的一種，在系統性紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化等疾病中異常表達，成為疾病診斷的標志物[14-15]。銀屑病是一種T 細胞介導皮膚病，研究顯示，miR-124-3p 在尋常型銀屑病患者皮損組織表達水平降低，與皮損面積和嚴重程度相關[16]。Zhang 等[17]研究顯示，miR-124-3p 在AR 模型小鼠鼻黏膜組織中下調表達，上調miR-124-3p 表達，可緩解AR 癥狀及降低血清炎癥因子水平。GATA3 屬于Ⅳ型鋅指蛋白家族，是Th2 細胞發育過程中重要的轉錄因子，可以促進Th2 相關細胞因子的表達與分化，在免疫調節中發揮重要作用[18]。研究顯示，GATA3 在AR小鼠肺組織中表達水平升高，給予玉屏風散治療后，GATA3 蛋白的表達降低，提示GATA3 在參與AR 的免疫調節中發揮作用[19]。本研究結果顯示，miR-124-3p在AR 患兒血清表達水平低于對照組，GATA3 水平高于對照組，且與輕度組比較，中重度組患兒血清miR-124-3p 表達水平顯著降低，GATA3 水平顯著升高，提示miR-124-3p、GATA3 與AR 患者病情嚴重程度有關。

正常生理條件下，Th1 和Th2 細胞處于相對平衡，保持機體免疫平衡，Th1 和Th2 細胞既互相拮抗又互相調節，機體在外界病原菌或過敏原刺激下，Th1/Th2 比例失衡導致機體免疫應答異常，引發疾病，Th1 和Th2 的免疫失衡是AR 的主要免疫學基礎與發病機制[20-21]。Th1 細胞主要分泌腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor，TNF-β）、IFN-γ、IL-2、IL-12 等細胞因子，介導細胞免疫，參與遲發型超敏性炎癥的形成，而Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細胞因子，介導體液免疫。研究顯示，AR 患者血清Th1 細胞亞群比例、Th1/Th2 比例、IL-4、IL-12 水平升高[22]。本研究結果顯示，AR 組Th1 細胞比例和Th1/Th2 顯著降低，Th2 細胞比例顯著升高，提示AR患兒體內Th1/Th2 比例失衡，Th2 細胞可能在AR 疾病中占免疫優勢。Th1 和Th2 免疫調節主要通過其細胞因子發揮作用，李滿群等[23]研究顯示，過敏性鼻炎患兒血清TNF-β、IFN-γ、IL-2、IL-12 水平顯著降低，血清IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 水平顯著升高，存在Th1/Th2 免疫失衡。本研究結果顯示，AR 組血清IFN-γ、IL-12 水平顯著降低，IL-4、IL-5、IL-10 水平顯著升高，與李滿群等[23]研究結果類似，提示AR 患兒體內有炎癥反應，Th1/Th2 免疫失衡。

Th1/Th2 失衡參與AR 發病的具體機制尚不清楚。本研究經相關性分析顯示，AR 患兒血清miR-124-3p表達水平與GATA3 水平呈負相關，且經生物學軟件在線分析顯示，miR-124-3p 與GATA3 有靶向結合位點，miR-124-3p 可能靶向負調控GATA3 表達。進一步研究顯示，miR-124-3p、GATA3 與Th1/Th2 失衡相關。研究顯示，富含miR-124-3p 外泌體可增強結直腸癌荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫反應，miR-124-3p 的過表達可促進Th1 細胞分化[24]。Th 前體細胞分化受GATA3 的轉錄調控，GATA3 可促進Th2 細胞的分化，并抑制IFN-γ 的生成[25]。因此，推測miR-124-3p 可能靶向負調控GATA3 表達，影響Th1、Th2 細胞分化，導致Th1/Th2 失衡，參與AR 病情進展。

綜上所述，AR 患兒血清miR-124-3p 表達水平降低，GATA3 水平升高，二者與患兒疾病嚴重程度和Th1/Th2 失衡有關。但miR-124-3p 與GATA3 具體作用機制需要做進一步研究。