lncRNA MEG3靶向miR-130a-5p調控人視網膜色素上皮細胞損傷的研究

曾清雨 湯中 李生富 唐云驄

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是一種常見的致盲性眼病，其通過影響視網膜的黃斑區域引起老年人嚴重和永久性視力障礙及失明，發生率較高，且至今無有效治療方法，極大影響患者生活質量［1-2］。目前研究認為視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞功能障礙在AMD發生和進展中發揮關鍵作用，在外源性刺激或內源性病理變化作用下，氧化應激和炎癥反應導致RPE細胞損傷，細胞凋亡增加［3-4］。

多個lncRNA和miRNA已被證實參與調控AMD發生發展，可作為AMD的診斷標志物和治療靶點［5-6］。其中lncRNA MEG3可通過靶向調控miR-93或miR-34a減輕高糖誘導的人RPE細胞ARPE-19凋亡和炎癥反應［7-8］。氧化應激也可誘導人RPE細胞中miR-130a-5p表達上調，提示miR-130a-5p可能參與氧化應激相關的AMD發病機制［9］。此外，研究發現，lncRNA MEG3可靶向調節miR-130a-5p表達［10］。基于此，本研究檢測lncRNA MEG3在AMD患者血清中的表達情況，并采用H2O2誘導建立人RPE細胞損傷模型，初步探究lncRNA MEG3對RPE細胞損傷的可能機制，以期為AMD研究以及治療靶點的選擇提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣本來源 選取2020年6月至2021年8月永州職業技術學院附屬醫院診治的AMD患者38例（38眼）為研究對象，符合《美國眼科學會年齡相關性黃斑變性臨床指南（2019）解讀》中的診斷標準［11］，男20例，女18例，年齡50～80歲，平均（62.38±6.82）歲。另選取同期本院健康體檢者38例作為對照，無眼部疾病及相關家族史，男21例，女17例，年齡51～80歲，平均（62.59±7.03）歲。本研究均經受試者知情同意并簽署知情同意書，且本研究經醫院倫理委員會批準（審批號：202005001）。

1.1.2 細胞來源 人RPE細胞系ARPE-19細胞（AC-2141H）來源于美國ATCC公司，使用含10%胎牛血清和雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM完全培養基重懸，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每兩天換液一次，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.1.3 主要試劑 過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）（88597）購自美國Millipore公司；lncRNA MEG3過表達載體（pcDNA3.1-lncRNA MEG3）和空載體對照（pcDNA3.1-NC）、miR-130a-5p模擬物（miR-130a-5p mimics）和陰性對照（miR-NC）由上海吉瑪公司提供；MTT試劑盒（IBO1079G）購自江西艾博因公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（11402ES60）購自上海翌圣公司；RNA結合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）試劑盒（RIP-12RXN）購自中國Sigma-aldrich公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（A003-1-2、A001-3-2）購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（EH0201、AQ-H0302-B、FN-EH4494）購自武漢菲恩生物科技有限公司；膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）∕碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（AD10-2）購自日本同仁公司；ROS檢測試劑盒（ab113851）及兔抗人核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、β-肌動蛋白（β-actin）、Argonaute2（Ago2）、IgG抗體（ab62352、ab52947、ab8227、ab156870、ab109489）購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RPE細胞損傷模型的構建 將處于對數生長期的ARPE-19細胞接種于96孔培養板（5 000個∕孔），待細胞貼壁后根據蘇途等［12］的方法和前期預實驗結果添加不同濃度的H2O2（0 μmol∕L、100 μmol∕L、200 μmol∕L、400 μmol∕L、600 μmol∕L），另設僅添加培養液的孔為調零組，每個處理設置6個復孔，置于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h，每孔添加20 μL MTT溶液（5 mg∕mL），孵育4 h后吸去上層培養液，每孔添加150 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），使用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度（optical density，OD）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-調零組OD值）∕（對照組OD值-調零組OD值）×100%。選取細胞存活率接近50%的H2O2濃度作為ARPE-19細胞損傷造模濃度。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因實驗 通過ENCORI數據庫（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）預測miR-130a-5p可能是lncRNA MEG3的靶點之一。將預測的lncRNA MEG3序列片段和突變片段分別插入到pmirGLO熒光素酶載體中，構建野生型載體（lncRNA MEG3-WT）和突變型載體（lncRNA MEG3-MUT）。采用脂質體法將所構建的lncRNA MEG3-WT、lncRNA MEG3-MUT分別與miR-130a-5p mimic或miR-NC共轉染至ARPE-19細胞，轉染48 h后進行熒光素酶活性檢測，具體操作嚴格按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明執行。

1.2.3 RNA結合蛋白免疫沉淀實驗 收集轉染miR-130a-5p mimic或miR-NC 48 h后的ARPE-19細胞，采用冷PBS洗滌后添加RNA結合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）裂解緩沖液裂解。將細胞裂解物與抗Argonaute2（Ago2）抗體（1%）或IgG抗體（1%）偶聯的磁珠于4°C下孵育過夜，洗滌磁珠后使用TRIzol試劑提取磁珠結合的RNA，qRT-PCR檢測lncRNA MEG3表達水平。

1.2.4 細胞分組與處理 ARPE-19細胞分為對照組（常規培養，不進行任何特殊處理）、H2O2組（200 μmol∕L H2O2處理24 h）、Vector組（轉染pcDNA3.1-NC 24 h后200 μmol∕L H2O2處理24 h）、lncRNA MEG3組（轉染pcDNA3.1-lncRNA MEG3 24 h后200 μmol∕L H2O2處理24 h）、lncRNA MEG3+miR-NC組（共轉染pcDNA3.1-lncRNA MEG3和miR-NC 24 h后200 μmol∕L H2O2處理24 h）、lncRNA MEG3+miR-130a-5p組（共轉染pcDNA3.1-lncRNA MEG3和miR-130a-5p mimics 24 h后200 μmol∕L H2O2處理24 h），所用轉染方法為脂質體法。

1.2.5 qRT-PCR檢測血清和細胞中lncRNA MEG3、miR-130a-5p表達水平 分別收集每位AMD患者和健康體檢者清晨空腹靜脈血5 mL，離心后收集血清，超低溫冰箱保存，備用）。TRIzol試劑提取血清和細胞中總RNA并將其逆轉錄合成cDNA，然后以cDNA為模板配制qRT-PCR反應體系，于qRT-PCR儀上進行擴增，獲取循環閾值（Ct值）。20 μL qRT-PCR反應體系：200 ng∕μL cDNA 2 μL，10 μmol∕L上、下游引物各1 μL（引物序列見表1，由上海吉瑪設計并合成），SYBR Green Mix 5 μL，無菌ddH2O 11 μL。反應程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算血清和細胞中lncRNA MEG3相對表達水平（內參基因為GAPDH），以及細胞中miR-130a-5p相對表達水平（內參基因為U6）。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.2.6 MTT法檢測細胞活性 將處于對數生長期的ARPE-19細胞接種于96孔培養板（5 000個∕孔），待細胞貼壁后按照1.2.4方法處理細胞，隨后參照1.2.1中所述步驟檢測各組ARPE-19細胞存活率。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集處理后的各組ARPE-19細胞，PBS洗滌后添加195 μL Annexin VFITC結合液重懸細胞，并依次添加5 μL Annexin VFITC和10 μL PI染色液室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測各組ARPE-19細胞凋亡率。

1.2.8 細胞內氧化應激指標檢測 收集處理后的各組ARPE-19細胞，參照ROS檢測試劑盒以及MDA、SOD測定試劑盒說明書操作，采用DCFH-DA熒光探針法檢測細胞熒光強度（激發波長485 nm，發射波長538 nm），根據熒光強度計算各組ARPE-19細胞內活性氧（reactive oxygen，ROS）水平（標準化為對照組）；分別采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法、水溶性四唑鹽1（water soluble tetrazolium salt 1，WST-1）法測定各組ARPE-19細胞內MDA、SOD水平。

1.2.9 細胞上清液中炎癥因子水平檢測 收集處理后的各組ARPE-19細胞上清液，參照IL-6、TNF-α、Aβ ELISA試劑盒說明操作，采用ELISA法檢測各組ARPE-19細胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平。

1.2.10 Western blot檢測細胞中Nrf2∕HO-1通路相關蛋白表達 收集處理后的各組ARPE-19細胞，添加裂解液于冰上充分裂解后離心，吸取上清液（即總蛋白），二辛可寧酸法定量蛋白濃度。各樣品取20 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后將分離的蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h后加入兔抗人Nrf2（1：1000）、HO-1（1：2000）、β-actin（1：2000）抗體4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液洗滌后加入辣根過氧物酶標記的山羊抗兔IgG（1：2000）室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后電化學發光試劑顯色。Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量（歸一化為內參蛋白β-actin）。

1.3 統計學方法 應用SPSS 25.0進行統計分析。正態分布計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA MEG3表達情況 AMD患者血清lncRNA MEG3表達水平為（0.61±0.16），低于健康體檢者（1.01±0.17），差異有統計學意義（t=10.562，P＜0.05）。見圖1。

圖1 血清lncRNA MEG3表達情況

2.2 RPE細胞存活率及lncRNA MEG3表達情況 與0 μmol∕L比較，100 μmol∕L、200 μmol∕L、400 μmol∕L、600 μmol∕L H2O2處理ARPE-19細胞后，細胞存活率依次降低（P＜0.05），細胞中lncRNA MEG3表達水平亦依次下調（P＜0.05）。見圖2。當H2O2處理濃度為200 μmol∕L時，細胞存活率最接近50%。

圖2 不同濃度H2O2處理后RPE細胞存活率和lncRNA MEG3表達水平

2.3 lncRNA MEG3與miR-130a-5p關系的驗證ENCORI數據庫（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）預測顯示lncRNA MEG3與miR-130a-5p存在靶向結合位點（圖3A）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與轉染miR-NC比較，同時轉染miR-130a-5p mimic和lncRNA MEG3-WT的細胞相對熒光素酶活性降低（P＜0.05），而同時轉染miR-130a-5p mimic和lncRNA MEG3-MUT的細胞相對熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3B。RIP實驗結果顯示，與轉染miR-NC的細胞比較，轉染miR-130a-5p mimic的細胞中Ago2抗體富集更多的lncRNA MEG3（P＜0.05），而轉染miR-130a-5p mimic的細胞中IgG抗體富集的lncRNA MEG3差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3C。

圖3 lncRNA MEG3與miR-130a-5p的靶向關系

2.4 lncRNA MEG3和miR-130a-5p表達水平比較與對照組比較，H2O2組ARPE-19細胞中lncRNA MEG3表達水平降低，miR-130a-5p表達水平升高（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細胞中lncRNA MEG3表達水平升高，miR-130a-5p表達水平降低（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細胞中lncRNA MEG3表達水平降低，miR-130a-5p表達水平升高（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細胞中lncRNA MEG3、miR-130a-5p表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組RPE細胞中lncRNA MEG3和miR-130a-5p表達水平比較

2.5 細胞活性和凋亡情況比較 與對照組比較，H2O2組ARPE-19細胞存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細胞存活率升高，凋亡率降低（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細胞存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細胞存活率、凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5、6。

圖5 流式細胞儀檢測RPE細胞凋亡

圖6 各組RPE細胞存活率和凋亡率比較

2.6 氧化應激情況比較 與對照組比較，H2O2組ARPE-19細胞內ROS、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細胞內ROS、MDA水平降低，SOD水平升高（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細胞內ROS、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細胞內ROS、MDA、SOD水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組RPE細胞內ROS、MDA、SOD水平比較

2.7 炎癥反應情況比較 與對照組比較，H2O2組ARPE-19細胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平升高（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平降低（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平升高（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖8。

圖8 各組RPE細胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ比較

2.8 Nrf2∕HO-1通路相關蛋白表達情況比較 與對照組比較，H2O2組ARPE-19細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與H2O2組、Vector組比較，lncRNA MEG3組ARPE-19細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與lncRNA MEG3組、lncRNA MEG3+miR-NC組比較，lncRNA MEG3+miR-130a-5p組ARPE-19細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；H2O2組和Vector組、lncRNA MEG3組和lncRNA MEG3+miR-NC組ARPE-19細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖9。

圖9 各組RPE細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達

3 討論

隨著全球人口老齡化加劇，AMD已成為導致老年群體失明的重要原因之一，為患者和社會帶來了沉重的精神和經濟負擔。因此，確定AMD的潛在治療靶點、早期規范治療對于AMD預后改善至關重要。研究表明，lncRNA（如lncRNA TUG1、lncRNA MALAT1、lncRNA MEG3）可影響RPE細胞功能，調節正常視覺功能，并可能導致視網膜功能障礙［13］。Sun等［14］發現lncRNA MEG3可通過miR-7-5p∕Pax6軸維持RPE分化，從而對AMD發揮保護作用，表明lncRNA MEG3可能是AMD治療中的一個保護性治療靶點。本研究結果顯示，lncRNA MEG3在AMD患者血清中低表達，提示lncRNA MEG3可能在AMD發生發展中發揮重要作用。

RPE介導的氧化應激廣泛參與AMD發病機理和進程，H2O2作為一種強氧化劑，通常在體外實驗中用于誘導RPE細胞氧化損傷［15-16］。本研究發現，不同濃度H2O2處理ARPE-19細胞均可降低細胞存活率，且當H2O2處理濃度為200 μmol∕L時，細胞存活率最接近50%，故而后續實驗選擇200 μmol∕L H2O2處理ARPE-19細胞進行造模。同時，本研究發現，H2O2誘導后細胞存活率、SOD水平降低，而細胞凋亡率及ROS、MDA、IL-6、TNF-α、Aβ水平升高。氧化應激是ROS大量產生和積累的結果，且ROS作用于脂質發生過氧化反應生成MDA，而SOD是抗氧化酶［17］。IL-6、TNF-α是促炎細胞因子，氧化應激可促進RPE細胞分泌更多的IL-6、TNF-α，進而誘導細胞氧化損傷［18］。Aβ亦可作為一種炎癥因子，其在眼內大量聚集，可直接損傷RPE細胞，已被證實是AMD發病機制的重要啟動因子［19］。以上結果均提示H2O2誘導ARPE-19細胞發生氧化應激和炎癥反應，導致細胞損傷。此外，H2O2處理可下調ARPE-19細胞中lncRNA MEG3表達水平，上調lncRNA MEG3可減輕H2O2誘導的ARPE-19細胞損傷，這進一步證實了lncRNA MEG3在RPE細胞損傷中的保護作用［14］。

本研究中，H2O2誘導的ARPE-19細胞中lncRNA MEG3表達下調的同時，發現miR-130a-5p表達水平上調，這與Ayaz等［9］研究結果一致。推測lncRNA MEG3、miR-130a-5p可能通過某種機制參與調控RPE細胞損傷。經ENCORI數據庫（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）分析以及雙熒光素酶報告基因實驗和RIP實驗驗證，發現人RPE細胞中lncRNA MEG3與miR-130a-5p存在靶向關系。此外，上調H2O2誘導的ARPE-19細胞中lncRNA MEG3表達可降低miR-130a-5p表達，且上調miR-130a-5p表達可部分減弱上調lncRNA MEG3表達對H2O2誘導的ARPE-19細胞損傷的減輕作用。提示上調lncRNA MEG3可靶向負調控miR-130a-5p表達減輕H2O2誘導的人RPE細胞氧化應激和炎癥反應，保護RPE細胞免受損傷。

Nrf2∕HO-1通路是重要的抗氧化應激通路，氧化應激狀態下，調節氧化還原平衡的關鍵轉錄因子Nrf2被活化后與抗氧化反應元件結合，上調下游HO-1等抗氧化因子，提高SOD等抗氧化酶的活性，從而減弱氧化應激和炎癥反應，抑制細胞凋亡［20-21］。本研究發現，上調lncRNA MEG3可升高H2O2誘導的ARPE-19細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達水平，且上調miR-130a-5p表達亦可部分減弱上調lncRNA MEG3表達對H2O2誘導的ARPE-19細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達水平的影響。提示Nrf2∕HO-1通路參與lncRNA MEG3靶向負調控miR-130a-5p對H2O2誘導的人RPE細胞損傷的保護作用。Luo等［7］研究顯示，lncRNA MEG3、Nrf2在高糖處理的人RPE細胞中均降低，lncRNA MEG3通過miR-93∕Nrf2軸抑制高糖誘導的RPE細胞凋亡和炎癥。

綜上所述，lncRNA MEG3在AMD患者血清中低表達，上調lncRNA MEG3可靶向負調控miR-130a-5p表達，激活Nrf2∕HO-1通路，減輕H2O2誘導的人RPE細胞氧化應激和炎癥反應，保護RPE細胞免受損傷。本研究為AMD發病機制研究以及治療靶點的選擇提供了新的思路。但miR-130a-5p是直接還是間接作用于Nrf2∕HO-1通路尚不清楚；此外，miR-130a-5p下游靶基因眾多，參與人RPE細胞損傷的lncRNA MEG3∕miR-130a-5p∕mRNA網絡仍有待挖掘。