千金子制霜前后提取物通過調控脂筏介導Caco-2細胞中TLR4信號通路的作用機制研究

王慧楠，魏曉彤，石雙慧，王夢琳，馬思媛，胡宇峰，姜明瑞，張婧秋，王英姿

千金子制霜前后提取物通過調控脂筏介導Caco-2細胞中TLR4信號通路的作用機制研究

王慧楠，魏曉彤，石雙慧，王夢琳，馬思媛，胡宇峰，姜明瑞，張婧秋，王英姿*

北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488

探究千金子制霜前后提取物通過調控脂筏介導Caco-2細胞中Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號通路的作用機制。將Caco-2細胞分為千金子生品低、中、高劑量（50、200、800 μg/mL）組及千金子霜品低、中、高劑量（50、200、800 μg/mL）組和對照組，利用流式細胞術檢測Caco-2細胞膜脂筏豐度；采用激光共聚焦實驗檢測Caco-2細胞中TLR4與脂筏的共定位；利用Western blotting檢測Caco-2細胞中TLR4、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）、p-NF-κB p65和NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）的蛋白表達；ELISA檢測Caco-2細胞上清液中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量；Caco-2細胞轉染后檢測IL-1β和TNF-α的含量變化。與對照組比較，千金子生品提取物可以顯著增加Caco-2細胞膜脂筏的豐度（＜0.01），促進TLR4向脂筏的募集（＜0.01），提高TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65和NLRP3的蛋白表達以及誘導IL-1β和TNF-α的釋放（＜0.05、0.01、0.001）。相同劑量下，與千金子生品提取物相比，千金子霜品提取物對Caco-2細胞膜脂筏豐度、TLR4向脂筏募集、TLR4介導的信號通路傳導和促炎因子分泌的影響均明顯減弱（＜0.05、0.01、0.001）。體外si轉染試驗結果進一步證實，Caco-2細胞轉染后TNF-α和IL-1β的含量顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。千金子制霜減毒的作用機制可能與通過調控脂筏豐度干擾TLR4向脂筏募集，最終影響脂筏中包含的TLR4信號蛋白的傳導有關。

千金子；制霜減毒；脂筏；Toll樣受體4；Caco-2細胞；千金子甾醇

千金子為大戟科植物續隨子L.的干燥成熟種子，具有瀉下逐水、破血消癥之效，可用于水腫、二便不通、痰飲、積滯脹滿、血瘀經閉，歷代多采用去油制霜法炮制以降低毒性、緩和瀉下作用[1-2]。脂筏是細胞膜內富含脂質以及蛋白質的動態微結構域，主要由膽固醇、鞘磷脂和脂筏連接信號蛋白構成，在物質運輸和細胞內信號轉導中扮演著重要的角色[3-4]。研究表明，膽固醇外流是調控脂筏的主要途徑，膽固醇從胞內流出的變化會極大地改變脂筏的豐度，影響脂筏中包含的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）下游的信號通路傳導[5]。課題組前期研究結果顯示，千金子制霜后可能通過肝X受體α（liver X receptor α，LXRα）-腺苷三磷酸結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）途徑調控人結直腸腺癌Caco-2細胞膽固醇外流[6]。體內實驗進一步發現，千金子制霜后對TLR4/核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）/NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）通路傳導及促炎因子分泌的上調作用弱于生品[7]，提示千金子制霜減毒的作用機制可能與通過LXRα-ABCA1途徑調節膽固醇外流，以及干預TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路有關，但膽固醇外流調控的細胞微區脂筏是否參與千金子制霜減毒的過程，以及其與TLR4介導的信號通路之間的關聯性有必要深入研究。因此，鑒于膜脂成分膽固醇、動態微結構域脂筏與TLR4下游信號通路之間的密切聯系，本研究擬采用流式細胞術、免疫熒光、Western blotting、ELISA、基因沉默等技術，系統探討千金子制霜前后提取物通過調控脂筏豐度對Caco-2細胞中TLR4通路傳導的影響差異，以期從分子水平解析千金子制霜減毒的作用機制，為其臨床安全有效應用奠定科學依據。

1 材料

1.1 藥材

千金子飲片（批號1203070692）購自安徽亳州，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為大戟科續隨子L.的干燥成熟種子；千金子霜由同一批千金子飲片按《中國藥典》2020年版制霜法（通則0213）制得，經測千金子脂肪油質量分數為48.61%，千金子霜脂肪油質量分數為19.21%。

1.2 細胞

Caco-2細胞（批號BNCC350769）購自北納生物BNCC。

1.3 藥品與試劑

PBS溶液（批號C10010500BT）、DMEM高糖培養基（批號C11995500BT）、0.25%胰酶-EDTA（批號25200-056）購自美國Gibco公司；重組霍亂毒素亞基B（CT-B）、AlexaFluor?488偶聯物（批號C22841）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號EMC102a）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號EMC001b）購自北京欣博盛生物科技有限公司；Lipo8000?轉染試劑（批號C0533FT）購自上海碧云天生物技術有限公司；DAPI染色液（批號r20276-10mL）購自上海源葉生物科技有限公司；TLR4單抗（批號66350-1-Ig）、NF-κB p65單抗（批號66535-1-Ig）購自美國Proteintech公司；p-NF-κB p65抗體（批號ab76302）、NLRP3單抗（批號ab263899）、Alexa Fluor?594 IgG抗體（批號ab150080）購自英國Abcam公司；β-actin單抗（批號AH11286487）、HRP標記的羊抗兔IgG抗體（批號BJ08079044）、TLR4多抗（批號bs-20379R）購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 儀器

Heracell? VIOS 160i型CO2培養箱、Attune NxT型流式細胞儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SpectraMax i3x型酶標儀（美國MD公司）；Tanon 1600型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；Countstar?RigelS5型智能圖像流式細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；TCS SP8 STED型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）；Direct-Q3型超純水儀（德國Millipore公司）。

2 方法

2.1 千金子生品與千金子霜品提取物的制備

稱取50 g千金子生品，加入300 mL 95%乙醇加熱回流提取3次，每次提取2 h，合并3次提取液，減壓回收乙醇，再用等體積石油醚萃取3次，減壓回收，即得千金子生品提取物；稱取50 g千金子霜品，重復上述操作，即得千金子霜品提取物，4 ℃保存備用。實驗時稀釋，最終得到生藥質量濃度為3.17 g/mL的千金子生品和千金子霜品提取物。經HPLC檢測千金子生品和千金子霜品提取物中千金子甾醇的質量分數分別為（3.81±0.03）、（2.03±0.01）mg/g。

2.2 細胞培養

Caco-2細胞接種于培養瓶中，用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，待細胞密度達到80%～90%時傳代。根據課題組前期千金子制霜前后提取物對Caco-2細胞存活率影響的結果[6]，本研究選擇50、200、800 μg/mL作為后續實驗質量濃度。

2.3 流式細胞術檢測Caco-2細胞膜脂筏豐度

取對數生長期的細胞，以1×105個/孔接種于6孔板中，培養至細胞貼壁，設置千金子生品（50、200、800 μg/mL）組，千金子霜品（50、200、800 μg/mL）組和對照組，每組設3個復孔，孵育48 h后，收集細胞，4 ℃、1000 r/min離心5 min，棄上清，用AlexaFluor?488標記的CT-B染色液（1 μg/mL）冰上避光染色10 min，4 ℃、1000 r/min離心4 min，棄上清，加入400 μL PBS分散細胞，使用流式細胞儀檢測熒光，對細胞膜上的脂筏進行定量分析。

2.4 激光共聚焦實驗檢測Caco-2細胞中TLR4與脂筏的共定位

取對數生長期的細胞，以1×105個/孔接種于共聚焦小皿中，培養至細胞貼壁，設置千金子生品（800 μg/mL）組、千金子霜品（800 μg/mL）組和對照組，每組設3個復孔，孵育48 h后，用AlexaFluor?488標記的CT-B染色液（1 μg/mL）冰上避光染色10 min，隨后加入4%多聚甲醛冰上固定15 min，加入5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；然后滴加TLR4抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，再滴加Alexa Fluor?594標記的二抗（1∶1000），避光孵育1 h后，加入DAPI溶液避光染色5～10 min；隨后滴加少量甘油，使用激光共聚焦顯微鏡拍照獲取圖像，其中AlexaFluor?488標記為綠色熒光，Alexa Fluor?594標記為紅色熒光，DAPI標記為藍色熒光；使用Image J軟件中的Coloc2插件進行TLR4與脂筏的共定位分析。

2.5 Western blotting檢測Caco-2細胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達

將對數生長期的細胞，按2×105個/孔接種于6孔板中，培養至細胞貼壁，設置千金子生品（50、200、800 μg/mL）組，千金子霜品（50、200、800 μg/mL）組和對照組，每組設3個復孔，孵育48 h后，吸棄上清，加入細胞裂解液裂解，收集細胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，BCA法進行蛋白定量。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉；TBST洗滌后，加入一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌后，采用凝膠成像系統顯色，使用Image J軟件分析Caco-2細胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65的蛋白表達。

2.6 ELISA檢測Caco-2細胞上清液中IL-1β和TNF-α水平

取對數生長期的細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中，培養至細胞貼壁，設置千金子生品（50、200、800 μg/mL）組，千金子霜品（50、200、800 μg/mL）組和對照組，每組設2個復孔，孵育48 h后，收集細胞上清液，4 ℃、3000 r/min離心25 min，按照試劑盒說明書檢測細胞上清液中IL-1β和TNF-α水平。

2.7 TLR4轉染后檢測Caco-2細胞上清液中IL-1β和TNF-α水平

將對數生長期的細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中，培養至細胞貼壁，實驗所用的siRNA（上游引物5’-CCAAGUAGUCUAGCUUUCUUAdTd-3’，下游引物5’-UAAGAAAGCUAGACUACUUGGAdTd-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，按照脂質體轉染試劑說明書進行轉染。轉染24 h后，設置千金子生品（50、200、800 μg/mL）組，千金子霜品（50、200、800 μg/mL）組和對照組，每組設2個復孔，孵育48 h后，收集細胞上清液，按照“2.6”項下方法檢測Caco-2細胞上清液中IL-1β和TNF-α水平。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 千金子制霜前后提取物對Caco-2細胞膜脂筏豐度的影響

如圖1所示，與對照組比較，千金子生品與霜品提取物均可顯著提高Caco-2細胞膜中脂筏豐度（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性；相同質量濃度下，與千金子生品組比較，千金子霜品可顯著減輕對Caco-2細胞膜中脂筏豐度的上調作用（＜0.05、0.01）。

3.2 千金子制霜前后提取物對Caco-2細胞中TLR4與脂筏共定位的影響

采用激光共聚焦顯微鏡對Caco-2細胞中TLR4與脂筏的共定位進行觀察，結果如圖2和表1所示，與對照組比較，千金子生品提取物可使Caco-2細胞中TLR4與脂筏的共定位顯著增加（＜0.01）；千金子霜品提取物作用于Caco-2細胞后，TLR4與脂筏的共定位程度略有增加，但與對照組相比無統計學意義；與千金子生品組相比，千金子霜品組對Caco-2細胞中TLR4與脂筏的共定位的影響顯著減輕（＜0.01）。

3.3 千金子制霜前后提取物對Caco-2細胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，各劑量的千金子生品提取物能夠顯著提高Caco-2細胞中TLR4和NLRP3的蛋白表達（＜0.05、0.001），低、高劑量的千金子生品提取物能夠顯著提高Caco-2細胞中NF-κB p65的蛋白表達（＜0.001），中、高劑量的千金子生品提取物能夠顯著提高Caco-2細胞中p-NF-κB p65/NF-κB p65的蛋白表達（＜0.001）；相同劑量下，與千金子生品提取物比較，千金子霜品提取物對Caco-2細胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平的調控作用均明顯減輕（＜0.01、0.001）。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與千金子生品組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，圖3同

脂筏富集區表現為綠色熒光，TLR4表現為紅色熒光，細胞核表現為藍色熒光

表1 Caco-2細胞中TLR4與脂筏的共定位系數(, n = 3)

與對照組比較：**＜0.01；與千金子生品組比較：##＜0.01

**< 0.01control group;##< 0.01group

3.4 千金子制霜前后提取物對Caco-2細胞上清液中IL-1β和TNF-α分泌的影響

如圖4所示，千金子制霜前后提取物干預Caco-2細胞48 h后，與對照組（NC）比較，千金子生品和霜品各劑量組均可顯著上調Caco-2細胞上清液中IL-1β和TNF-α的含量（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性；相同劑量下，與千金子生品比較，千金子霜品提取物對上清液中IL-1β和TNF-α含量的上調作用明顯減弱（＜0.05、0.01）。

3.5 TLR4基因沉默后對Caco-2細胞IL-1β和TNF-α分泌的影響

如圖4所示，用siRNA-1772轉染Caco-2細胞24 h后，給予千金子生品與霜品提取物刺激48 h，與對照組（-siRNA）比較，千金子生品各劑量組及霜品中、高劑量組均可促進Caco-2細胞分泌TNF-α和IL-1β（＜0.05、0.01、0.001）；相同劑量下，與千金子生品比較，千金子霜品提取物可以顯著減弱對TNF-α和IL-1β含量的上調（＜0.05、0.01），這與沉默前千金子制霜前后提取物對Caco-2細胞IL-1β和TNF-α含量的影響趨勢一致。與相同劑量下的未轉染組（NC）比較，沉默后，Caco-2細胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

圖3 千金子制霜前后提取物對Caco-2細胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達的影響(, n = 3)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與千金子生品組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與未轉染（NC）組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001

4 討論

課題組前期研究發現，千金子制霜前后提取物可通過LXRα-ABCA1影響Caco-2細胞中膽固醇外流[6]。由于膽固醇是脂筏的主要組成成分，其在脂筏的形成中發揮關鍵作用，脂筏的含量受細胞膽固醇外流途徑的高度調節[8-9]。因此，本研究采用流式細胞術進一步考察千金子制霜前后對Caco-2細胞膜脂筏豐度的影響，結果表明千金子制霜前后提取物均可顯著增加Caco-2細胞膜脂筏豐度，而制霜后對Caco-2細胞膜脂筏含量的上調作用較生品減弱，說明千金子制霜前后可能通過LXRα-ABCA1途徑調節膽固醇外流，進而影響脂筏的豐度及其功能，制霜后可以減輕對Caco-2細胞膜脂筏豐度的影響。

脂筏作為質膜上的重要功能平臺，在TLR4介導的信號轉導和靶向促炎因子表達中扮演關鍵角色[10-11]。脂筏含量的增加會導致TLR4受體在脂筏中占據時間變長、信號增強，進而引起炎癥[12-15]。為探究千金子制霜前后是否會通過調控Caco-2細胞膜脂筏豐度影響TLR4向脂筏的募集，本研究應用激光共聚焦顯微鏡考察千金子制霜前后對TLR4和脂筏共定位的影響，結果顯示千金子制霜前后提取物均可促進TLR4向脂筏的募集；而制霜后對Caco-2細胞中TLR4向脂筏中募集的促進作用明顯弱于生品。此結果進一步表明，千金子制霜減毒作用是通過調控細胞膜微區脂筏豐度影響Caco-2細胞中TLR4向脂筏的募集實現的。

此外，課題組前期研究結果還表明，千金子制霜減毒的作用機制與致炎能力下降以及干預小鼠結腸組織中TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路有關[7]。為了更深入地研究千金子制霜前后是否能夠通過影響TLR4向脂筏募集進一步干擾Caco-2細胞中TLR4下游信號通路傳導，本研究利用Western blotting和ELISA分別檢測千金子制霜前后提取物對TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3蛋白表達和IL-1β、TNF-α釋放的影響，結果表明千金子生品可以提高Caco-2細胞脂筏中所含有的TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達，促進IL-1β和TNF-α的釋放；而制霜后可不同程度地逆轉千金子誘導的TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、IL-1β和TNF-α水平的增高，與體內實驗結果一致，提示千金子生品可以促進TLR4向脂筏的募集，誘導TLR4復合物進入細胞質中，使得NF-κB p65從細胞質轉移到細胞核，并提高NLRP3蛋白和炎癥因子的表達；千金子制霜后可通過調控細胞膜微區脂筏豐度影響TLR4向脂筏的募集，進而干預脂筏中包含的TLR4信號級聯，降低Caco-2細胞體外毒性。體外siRNA沉默技術顯示Caco-2細胞轉染后，IL-1β和TNF-α的含量顯著降低，進一步證實千金子制霜前后對Caco-2細胞中IL-1β和TNF-α含量的上調作用與TLR4信號通路有關。但除了TLR4介導的NF-κB/NLRP3途徑外，TLR4還可介導絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸激酶、干擾素調節因子3等多種信號途徑[16]，本研究結果尚不能揭示千金子制霜前后提取物對其他途徑的調控作用，后續將對TLR4介導的其他炎癥信號通路開展研究。

綜上，本研究發現千金子生品可以顯著改善Caco-2細胞脂筏豐度，促進TLR4向脂筏募集，從而誘導TLR4/NF-κB/NLRP3途徑的激活和TNF-α和IL-1β的釋放，而制霜后對脂筏豐度、TLR4向脂筏募集、TLR4/NF-κB/NLRP3通路傳導以及下游促炎因子分泌的影響均明顯減弱，提示千金子制霜減毒的作用機制可能與影響細胞膜微區脂筏豐度從而干擾Caco-2細胞中TLR4信號通路傳導有關，此結果可為深入探討千金子制霜減毒機制提供重要依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of extracts frombefore and after frosting mediating TLR4 signaling pathway in Caco-2 cells via regulating lipid rafts

WANG Hui-nan, WEI Xiao-tong, SHI Shuang-hui, WANG Meng-lin, MA Si-yuan, HU Yu-feng, JIANG Ming-rui, ZHANG Jing-qiu, WANG Ying-zi

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To study the mechanism of extracts from Qianjinzi () and Qianjinzishuang () mediating Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway in Caco-2 cells via regulating lipid rafts.Caco-2 cells were divided intolow-, medium- and high-dose (50, 200, 800 μg/mL) groups,low-, medium- and high-dose (50, 200, 800 μg/mL) groups and control group. Flow cytometry was used to detect the lipid rafts abundance of Caco-2 cells membrane. Confocal laser scanning microscope was used for studying the co-localization of TLR4 and lipid rafts in Caco-2 cells. Western blotting was applied to detect TLR4, nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), p-NF-κB p65 and NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3) protein expressions in Caco-2 cells. Furthermore, ELISA was applied to determine the levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the supernatant of Caco-2 cells. And the levels of IL-1β and TNF-α were detected in Caco-2 cells after transfection with.Compared with control group,extracts could increase the content of lipid rafts (< 0.01), promote the recruitment of TLR4 to lipid rafts (< 0.01), increase the protein expressions of TLR4, NF-κB p65, p-NF-κB p65 and NLRP3, as well as induce the release of IL-1β and TNF-α in Caco-2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001). However, the effects ofextracts on the abundance of lipid rafts, the recruitment of TLR4 to lipid rafts, the conduction of TLR4-mediated signaling pathways and the secretion of pro-inflammatory factors were significantly weaker than those ofextracts at the same dose (< 0.05, 0.01, 0.001). In addition, the results of sitransfectionfurther confirmed that the content of IL-1β and TNF-α were significantly decreased after transfection ofin Caco-2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001).The attenuation mechanism of processing formay be closely related to interfering the recruitment of TLR4 to lipid rafts by regulating lipid rafts abundance, and ultimately affecting the cascade of TLR4 signaling protein contained in lipid rafts.

; attenuating toxicity of frosting; lipid rafts; Toll-like receptor 4; Caco-2 cells; euphobiasteroid

R285.5

A

0253 - 2670(2023)22 - 7474 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.024

2023-07-10

國家自然科學基金資助項目（82074021）

王慧楠（1997—），女，博士研究生，從事中藥制劑新技術與中藥炮制原理研究。E-mail: 2672667045@qq.com

通信作者：王英姿（1975—），女，博士，教授，博士生導師，從事中藥制劑新技術與中藥炮制原理研究。Tel: (010)84738615 E-mail: wangyzi@sina.com

[責任編輯 李亞楠]