黃芩素-冰片抗腦缺血后內皮功能障礙的作用及機制

賀一凡，張行行, 2，唐長杰，陳 旭，崖壯舉，周子燁，王 斌，韓朝軍，劉繼平，史永恒*

黃芩素-冰片抗腦缺血后內皮功能障礙的作用及機制

賀一凡1，張行行1, 2，唐長杰1，陳 旭1，崖壯舉1，周子燁1，王 斌1，韓朝軍1，劉繼平1，史永恒1*

1. 陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046 2. 商洛市中醫醫院，陜西 商洛 726000

探究黃芩素、冰片及配伍對腦基底血管張力的影響和抗腦缺血后腦基底血管內皮功能障礙的作用及機制。采用離體血管環實驗分別考察累積濃度的黃芩素、冰片及不同比例配伍對靜息狀態和內皮素-1（endothelin-1，ET-1）、血栓素A2類似物（U46619）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）預收縮的腦基底血管環張力的影響。利用線栓法構建局灶性腦缺血模型，給予不同比例的黃芩素-冰片，進行神經功能評分；采用紅四氮唑（2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色觀察腦梗死體積；熒光染色法觀察缺血側皮層CD34表達；檢測缺血側皮層一氧化氮（nitric oxide，NO）水平；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦基底動脈血管內皮完整性；Western blotting檢測腦基底動脈內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達；ELISA法檢測血清中炎性因子水平。黃芩素、冰片和各比例配伍組對基礎狀態血管環張力無明顯影響，但能明顯舒張由ET-1、U46619、5-HT預收縮的腦基底血管環（＜0.05、0.01），且隨著濃度增大，黃芩素-冰片（1∶3）對ET-1、U46619預收血管環的舒張作用具有明顯的優勢。大腦中動脈局灶性梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）術后大鼠神經功能評分顯著升高（＜0.01），藥物干預24 h后，神經功能評分不同程度降低（＜0.01）；與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率顯著升高（＜0.01），腦基底動脈內皮損傷嚴重、斷裂，eNOS表達顯著降低（＜0.05），iNOS表達顯著升高（＜0.01），缺血側皮層中CD34表達升高（＜0.01），NO水平顯著降低（＜0.01），血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平明顯升高（＜0.01），轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平明顯降低（＜0.01）；而黃芩素-冰片能不同程度明顯降低大鼠腦梗死率（＜0.01），改善腦基底動脈內皮狀態，升高動脈中eNOS表達、缺血側皮層中NO、CD34表達和血清中TGF-β表達（＜0.05、0.01），下調腦基底動脈中iNOS表達和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平（＜0.05、0.01）。黃芩素、冰片及配伍可抑制由ET-1、U46619和5-HT誘發的血管收縮，且黃芩素-冰片（1∶3）的舒張作用優于其余各組，其可抑制過度炎性反應，上調缺血后微血管eNOS表達，下調iNOS表達，促進NO合成和分泌，發揮抗缺血區微血管內皮功能障礙和促進恢復，改善微循環，減輕神經損傷的作用。

腦缺血；黃芩素；冰片；內皮功能障礙；血管環

腦卒中是一個危害性極大的綜合性神經疾病，主要是由于血管栓塞形成或血管性疾病引發的大腦局部血流減少或缺失[1]，現代社會腦缺血的發病率逐年激增，雖然近幾年發達地區腦卒中的發病率首次出現了下降，但我國腦卒中患者的發病率仍然在上升，并有年輕化趨勢，我國腦卒中現患人數高居世界首位，給社會造成了非常沉重的負擔[2]。因此，如何科學、有效地防治腦缺血的發生發展已經是醫學研究的迫切需要。

正常生理情況下，內皮細胞可合成釋放多種血管活性物質，維持血管各項生理功能[3]。腦缺血發生后，氧糖供應與消耗紊亂，腦組織產生梗死，而梗死灶邊緣產生多種復雜效應，激活腦內免疫細胞，釋放大量炎性介質、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），引發持續的炎癥反應和氧化應激，加重能量供應障礙，損傷內皮細胞，引起內皮細胞體積縮小、胞間間隙變大，引發血管活性物質紊亂，引發微血管攣縮和血栓形成進一步加重缺血性損傷[4]。研究發現，缺血早期梗死邊緣任有恢復的可能，因此如何在缺血早期針對內皮功能障礙進行干預，改善血管狀態，改善微循環成為預防和治療腦缺血的一個新的靶點和突破[5]。

中藥在治療此類復雜疾病時表現出獨特優勢，多數中藥在不同時間段對腦缺血都表現出了良好的治療作用[6]。近年來多項研究發現黃芩素、冰片具有舒張血管、保護血管內皮和改善內皮功能障礙的作用，但對二者配伍使用的研究較少，因此，本研究擬通過離體肌張力描記技術和建立腦缺血模型大鼠，探討黃芩素-冰片不同比例配伍對腦基底血管的舒張作用及改善腦缺血后內皮功能障礙的作用及機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠100只，體質量（220±20）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證編號SCXK（川）2020-030。飼養于陜西中醫藥大學中藥藥理實驗動物房內，溫度23～25 ℃，相對濕度45%～55%，自由攝食與飲水，晝夜各半，適應性飼養1周。實驗過程中對動物的處置符合《實驗動物福利倫理審查指南》（GB/T 35892－2018）《關于善待實驗動物的指導性意見》和陜西中醫藥大學倫理委員會規定和相關管理條例，動物實驗符合3R原則，本實驗通過動物實驗倫理審查（倫理批號SUCMDL20220301001）。

1.2 藥品與試劑

黃芩素（質量分數≥95%，批號S25956）、冰片（質量分數≥98%，批號S47379）、紅四氮唑（2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC，質量分數≥98%，批號L28J12S139144）均購自上海源葉生物科技有限公司；戊巴比妥鈉（批號061222）購自北京化學試劑公司；PBS溶液（批號BB0830）、4%組織固定液（貨號BB0808）均購自陜西中暉赫彩生物醫藥科技有限公司；線栓（批號MSRC40B200PK50）購自瑞沃德生命科技有限公司；血栓素A2類似物（U46619，質量分數≥98%，批號GC132051）購自美國GLPBIO公司；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT，批號SLCF8396）、內皮素-1（endothelin-1，ET-1，批號088M4849V）均購自美國Sigma公司；氯化鈉（批號202012C8）、磷酸二氫鈉（批號20220302）、無水氯化鈣（批號20210506）、碳酸氫鈉（批號20220102）均購自天力化學試劑有限公司；氯化鎂（批號20190103）、葡萄糖（批號20190504）均購自大茂化學試劑廠；內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）一抗（批號ab215717）購自英國Abcam公司；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）一抗（批號BS-0162R）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（批號BS-2188R）均購自北京博奧森生物技術有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號YC0403）購自美國MP公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號P0028）、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號S0021）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號C0105）均購自碧云天生物技術研究所；鼠抗兔IgG二抗（批號20207076s）購自美國CST公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號0047R2）、IL-6 ELISA試劑盒（批號0190R2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號0194R2）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA試劑盒（批號0181R1）均購自江蘇酶免實業有限公司；TRIzol試劑（批號262305）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

Exicycler 96熒光定量PCR儀（韓國Bioneer公司）；DMT 630M型離體微血管張力測定系統（丹麥DMT公司）；肌張力描記記錄系統（澳大利亞ADI公司）；電泳儀、轉膜儀及化學發光系統（美國Bio-Rad公司）；NW10LVF型超純水系統（Heal Force公司）；L420型離心機（北京六一生物科技有限公司）；DP73型顯微鏡拍照系統（日本Olympus公司）；800TS型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；DH36001B型電熱恒溫培養箱（天津泰斯特儀器有限公司）；H-2050R型冷凍超速離心機（湖南湘儀集團）；Alpha 7R III型全畫幅微單?數碼相機（日本索尼公司）；KZ-II型高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 肌張力描記測定血管張力

SD大鼠經1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，腹主動脈采血處死，斷頸小心取出全腦（連同小腦及延腦），浸于預冷的Na＋-PSS溶液（NaCl 119 mmol/L、NaHCO315 mmol/L、KCl 4.6 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、NaH2PO41.2 mmol/L、CaCl21.5 mmol/L和葡萄糖5.5 mmol/L）中，顯微鏡下分離腦基底動脈，剝離周圍組織，切成2～3 mm血管環，穿入2根40 μm的金屬絲（注意穿過血管環時避免損傷血管內皮），然后迅速移至預先加熱37 ℃，通入95% O2、5% CO2混合氣體的浴槽中，將2根金屬絲分別與可調節預張力的張力微調裝置和張力換能器，固定好的動脈環平衡20 min后，分3次施加1 mN預張力，每次間隔10 min；更換5 mL 60 mmol/L K＋-PSS溶液檢驗動脈環收縮活性，重復2次，當2次刺激的收縮幅度小于10%時可用于正式實驗[7]。在基礎狀態下以及ET-1、U46619、5-HT預收縮血管環后，分別加入累積濃度為1×10?6～1×10?3mol/L的黃芩素、冰片、黃芩素-冰片（1∶1）、黃芩素-冰片（1∶3）和黃芩素-冰片（3∶1）進行血管張力的測定。

2.2 大腦中動脈局灶性梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型考察黃芩素、冰片抗腦缺血后血管內皮障礙的作用及機制

2.2.1 動物分組、造模及給藥 將70只大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組和黃芩素-冰片高、中、低劑量（200、100、50 mg/kg，分別相當于成人臨床劑量的8、4、2倍）[8-11]組。大鼠適應性飼養1周后，各給藥組ig相應藥物，假手術組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續7 d。末次給藥結束后，禁食12 h，1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，模型組和各給藥組采用改良Longa線栓法建立右側MCAO模型：大鼠仰臥位固定于鼠板，頸部消毒備皮，正中切口1.5 cm，鈍性分離皮下筋膜，分離頸動脈，夾閉頸總動脈，由頸外動脈插入線栓，至線栓18 mm標記進入頸內動脈與頸總動脈分叉處，術中和術后保溫。假手術組大鼠除不插線栓外，其他與模型組大鼠操作一致。分別于造模后2、24 h進行神經功能評分，取材，進行相關指標的測定[12]。

2.2.2 神經功能評分 所有大鼠均在造模2、24 h后參考改良的Zea-Longa 8級7分神經功能缺損評分法對各組大鼠進行評分[13]。

2.2.3 TTC染色計算腦梗死面積 取大鼠腦組織用于TTC染色：斷頭取出腦組織，用預冷的生理鹽水清洗干凈，吸水紙吸干表面水分，去除嗅球、小腦、腦干，?20 ℃冷凍20 min，待其凍硬后，于冠狀位用手術刀等分切為4片2～3 mm厚的切片，置于12孔板中，每孔1片，加入37 ℃、2% TTC染液，每孔加1片22 mm圓形蓋玻片封頂，錫紙密封，于37 ℃孵育箱內孵育20 min，期間搖晃1～2次，使染色均勻。孵育結束后，吸出染液，加PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定48 h后，將切片置于相同藍色背景上，使用高清微距相機拍照，Image J軟件計算梗死部分體積及全腦體積，計算腦梗死率。

腦梗死率＝梗死部分體積/全腦體積

2.2.4 HE染色腦基底動脈觀察血管內皮狀態 取出大鼠腦基底動脈，用預冷的生理鹽水清洗干凈，吸水紙吸干表面多余水分，4%多聚甲醛固定72 h后，經脫水、包埋、切片、脫蠟、染色、制片，光鏡下不同倍數觀察心肌組織病理學狀態，選取固定位置拍照。

2.2.5 熒光染色法檢測缺血側皮層CD34表達 切片脫蠟至水，于EDTA抗原修復緩沖液中進行抗原修復，冷卻后，PBS洗滌3次，每次5 min，用組化筆圈住組織，放入3%過氧化氫溶液，室溫下避光孵育25 min，洗滌甩干，滴加牛血清白蛋白，5%山羊血清封閉30 min。加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌，在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫下孵育50 min，洗滌，滴加CY3-TSA，室溫避光孵育10 min，TBST洗滌3次，每次5 min。切片置于EDTA抗原修復緩沖液中加熱處理，在圈內滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min，洗滌，在圈內加入自發熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min，用DAPI抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.2.6 檢測缺血側腦組織NO水平 準確稱取缺血側腦組織，加入9倍體積的0.9%生理鹽水，冰水浴條件下，機械勻漿，制備成10%的勻漿液，3000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒操作步驟測定缺血側腦組織NO水平。

2.2.7 ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β水平 血液樣本常溫靜置30 min，3000 r/min離心15 min，分裝血清，?80 ℃凍存，按照試劑盒說明書測定血清中L-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β水平。

2.2.8 Western blotting檢測腦基底動脈eNOS和iNOS蛋白表達 分別取缺血側皮層、腦基底動脈組織，加入RIPA裂解液提取蛋白并測定蛋白濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后加入抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；洗滌后加入二抗（1∶5000）孵育，洗滌后加入ECL超敏發光液顯影，采用成像儀攝像、測量，利用Image Pro Plus 5.0軟件分析條帶灰度值。

2.3 統計學分析

3 結果

3.1 黃芩素-冰片對血管環的舒張作用

3.1.1 黃芩素、冰片對基礎狀態的血管環張力的作用 血管環施加1 mN預張力，平衡后，分別累積濃度加入DMSO、黃芩素、冰片、黃芩素-冰片（1∶1）、黃芩素-冰片（1∶3）和黃芩素-冰片（3∶1），監測血管張力變化并計算血管舒張率，結果見圖1-A，濃度為1×10?6～1×10?3mol/L時，黃芩素、冰片及不同比例配伍應用均對基礎狀態的腦基底血管環張力無明顯。提示各藥物組對正常狀態血管張力無明顯影響。

3.1.2 不同比例黃芩素-冰片對ET-1預收縮的血管環張力的影響 平衡后，使用1×10?6mol/L ET-1預收縮血管環，累積濃度加入對應藥物，監測血管張力變化并計算血管舒張率，結果見圖1-B，冰片、黃芩素及各比例配伍在濃度為1×10?4～1×10?3mol/L時表現出了顯著的舒張血管作用（＜0.01），隨著藥物濃度的增加，黃芩素-冰片（1∶3）的舒張作用明顯大于其他藥物組。提示各藥物組能顯著舒張由ET-1預收縮的腦基底血管環，且高濃度的黃芩素-冰片（1∶3）的舒張作用強于其他藥物組。

A-對基礎狀態血管環張力的影響 B-對ET-1預收縮的血管環張力的影響 C-對U46619預收縮的血管環張力的影響 D-對5-HT預收縮的血管環張力的影響 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.1.3 不同比例黃芩素-冰片對U46619預收縮的血管環張力的影響 平衡后，使用1×10?6mol/L U46619預收縮血管環，累加濃度加入對應藥物，監測血管張力變化并計算血管舒張率，結果見圖1-C，所有藥物組均在1×10?4～1×10?3mol/L時表現出了顯著的舒張血管作用（＜0.01），且與濃度呈正相關，隨著藥物濃度的增加，黃芩素-冰片（1∶3）對血管環的舒張作用明顯大于其他藥物組。提示各藥物組能顯著舒張由U46619預收縮的腦基底血管環，且濃度增大時，黃芩素-冰片（1∶3）對的舒張作用強于其他藥物組。

3.1.4 不同比例黃芩素-冰片對5-HT預收縮的血管環張力的影響 平衡后，使用1×10?6mol/L 5-HT預收縮血管環，累加濃度加入對應藥物，監測血管張力變化并計算血管舒張率，結果見圖1-D，隨著藥物濃度的增加，各藥物組均表現出了顯著的舒張作用（＜0.01），且各藥物組之間無明顯差異。提示各給藥組均能顯著舒張由5-HT預收縮的腦基底血管環，且各藥物組無顯著差異。

基礎狀態的血管內皮細胞通過調控縮血管物質ET-1、血管緊張素II（angiotensin II，AngII）、血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）、ROS和血管舒張因子NO和前列環素（prostacyclin，PGI2）和內皮衍生超級化因子（endothelium‐derived hyperpolarizing factors，EDHFs）等血管活性物質參與血管張力的調節，正常生理狀態下，二者維持表達平衡，但在腦缺血發生后，缺血區缺氧缺糖誘導一系列反應直接刺激內皮細胞損傷，導致縮血管物質分泌增加，而舒血管物質降低，誘發內皮功能障礙，進一步使血管收縮，減少缺血區血流量，加重腦損傷[14]。上述研究結果顯示，黃芩素、冰片和各比例配伍組對基礎狀態血管環張力無明顯影響，能明顯舒張由ET-1、U46619、5-HT預收縮的腦基底血管環，且隨著濃度增大，黃芩素-冰片（1∶3）對ET-1、U46619預收血管環的舒張作用具有明顯的優勢。因此，選擇黃芩素-冰片（1∶3）繼續后續研究，構建MCAO模型大鼠，初步在體探究黃芩素-冰片（1∶3）抗腦缺血后內皮功能障礙的作用及機制。

3.2 黃芩素-冰片對MCAO大鼠神經功能評分的影響

術后2 h，所有大鼠都表現出了不同程度的右側腦缺血癥狀，即表現為活動減少，提尾后前肢無法完全伸直，左側前肢收回置于胸壁，向左側轉圈或傾倒，神經功能評分穩定且各組之間無明顯差異，提示模型構建成功。造模過程中各組均有造模失?。ㄔ炷＿^程中出現的死亡以及造模結束后神經功能評分低于1分），共20只。造模成功率71.4%。如圖2所示，藥物干預24 h后，與模型組比較，黃芩素-冰片中、高劑量組神經功能評分顯著降低神經功能評分（＜0.01），低劑量組對MCAO大鼠神經功能評分無明顯影響。提示中、高劑量的黃芩素-冰片能一定程度改善神經功能。

3.3 黃芩素-冰片對MCAO大鼠腦梗死率的影響

TTC染液可將正常腦組織染成紅色，將梗死區域染成白色。如圖3所示，與假手術組比較，模型組梗死體積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，黃芩素-冰片低、中、高劑量組大鼠腦梗死率顯著降低（＜0.01）。提示黃芩素-冰片能降低腦梗死率，改善腦損傷。

與同時間假手術組比較：**P＜0.01；與同時間模型組比較：##P＜0.01

與假手術組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

3.4 黃芩素-冰片對MCAO大鼠缺血側皮層CD34表達的影響

CD34是內皮細胞損傷后修復的重要物質之一，也是內皮細胞首選標志物，血管新生發生與CD34表達呈正相關。利用熒光染色標記缺血側皮層CD34表達，考察黃芩素-冰片對缺血側皮層血管修復和新生的影響。如圖4所示，與假手術組比較，模型組大鼠缺血側皮層中CD34表達顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，黃芩素-冰片中、高劑量組大鼠缺血側皮層中CD34表達顯著增加（＜0.01），低劑量對CD34表達無明顯影響。表明黃芩素-冰片可促進MCAO模型大鼠缺血區微血管新生和恢復。

3.5 黃芩素-冰片對MCAO大鼠腦基底動脈內皮完整性的影響

如圖5所示，假手術組大鼠腦基底血管內皮細胞連續、完整，無明顯病理損傷；模型組大鼠腦基底動脈內皮完整性嚴重受損、出現缺失，內皮皺縮，黃芩素-冰片低、中、高劑量組大鼠內皮損傷程度和完整性得到不同程度恢復。提示黃芩素-冰片對腦缺血后血管內皮具有保護作用。

3.6 黃芩素-冰片對MCAO大鼠腦基底動脈eNOS和iNOS蛋白表達的影響

如圖6所示，與假手術組比較，模型組大鼠腦基底動脈eNOS蛋白表達水平明顯降低（＜0.05），iNOS蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，黃芩素-冰片低、中、高劑量組大鼠腦基底動脈eNOS蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），iNOS蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01），提示黃芩素-冰片能上調缺血后腦基底動脈eNOS表達、下調iNOS表達，調控eNOS/iNOS平衡，發揮抗內皮功能障礙作用。

圖4 黃芩素-冰片對MCAO大鼠缺血側皮層CD34表達的影響(, n = 3)

箭頭所示為血管內皮細胞

圖6 黃芩素-冰片對MCAO大鼠腦基底動脈eNOS和iNOS蛋白表達的影響(, n = 3)

3.7 黃芩素-冰片對MCAO大鼠缺血側皮層NO水平的影響

NO是主要的擴血管物質，組織中NO水平能在一定程度上反映血管內皮功能狀態。如圖7所示，與假手術組比較，模型組大鼠缺血側皮層中NO水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，黃芩素-冰片中、高劑量組大鼠缺血側皮層中NO水平顯著升高（＜0.01），低劑量組大鼠缺血側皮層中NO水平無明顯變化。提示黃芩素-冰片能上調缺血側腦皮層中NO水平，改善血管功能，參與血管舒張。

圖7 黃芩素-冰片對MCAO大鼠缺血側皮層NO水平的影響(, n = 3)

3.8 黃芩素-冰片對MCAO大鼠血清中炎性因子水平的影響

如圖8所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高（＜0.01），TGF-β水平降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低（＜0.05、0.01），TGF-β水平明顯升高（＜0.05、0.01）。提示黃芩素-冰片能抑制MCAO大鼠體內炎癥反應。

圖8 黃芩素-冰片對MCAO大鼠血清中炎性因子水平的影響(, n = 6)

4 討論

心腦血管疾病具有發病隱匿、病因復雜等特點，常造成多個器官的結構或功能損害[15]。據統計，腦缺血是世界上致死和致殘的第3大原因，缺血性卒中在所有新發卒中中所占比例最大[16]。相關研究表明，腦缺血病機涉及氧化應激、炎癥、凋亡等多種復雜機制[17]。腦缺血發生后，缺血中心區的星膠質細胞和小膠質細胞被激活后會釋放出大量的ROS和RNS，ROS和RNS在機體組織或細胞內的大量蓄積會打破黃嘌呤氧化酶、還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等促氧化酶和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶等抗氧化酶的平衡，造成氧化/氮化應激反應[18]，加劇炎癥反應，損傷內皮，內皮細胞凋亡，造成血管內皮功能障礙[19]。本研究利用線栓法構建MCAO模型大鼠，術后大鼠神經功能評分顯著升高，且各組間無明顯差異，提示模型構建成果且穩定；TTC染色結果也能看出，模型組大鼠腦梗死率顯著升高，而黃芩素-冰片干預后能明顯降低大鼠腦梗死率，表明黃芩素-冰片具有改善腦缺血后神經功能損傷和降低腦梗死率的作用。

血管內皮細胞是連續覆蓋在血管內壁表皮的單層扁平狀細胞，緊貼血管壁生長，維持血管管腔光滑以減輕由血液流動產生的剪切應力，其可作為一個調節體液、營養物質和代謝物交換的關鍵介質的內分泌器官[20]，在調節血管收縮或舒張、血管張力、血管重塑、控制血栓形成、細胞黏附、平滑肌細胞增殖和血管炎癥方面具有重要意義[21]。生理情況下，內皮細胞可釋放NO、PGI2等舒血管物質和ET-1、AngⅡ、TXA2等縮血管物質，這些血管活性物質的濃度在局部保持一定的比例，使血管的舒張與收縮功能保持動態平衡，進一步調節血管張力和血管平滑肌功能狀態[22]。已有研究表明，黃芩素可部分內皮依賴性地舒張去甲腎上腺素收縮的離體大鼠胸主動脈環，內皮依賴性舒張作用可能與前列環素途徑相關，非內皮依賴途徑可能與三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）敏感性鉀通道和鈣離子通道相關[23]。黃芩素低濃度下表現出收縮大鼠腸系膜動脈環及抑制乙酰膽堿舒張血管的作用[24]。冰片可通過血管平滑肌細胞的電壓依賴性鈣通道、受體操縱性鈣通道及其介導的外鈣內流和內鈣釋放等途徑參與血管舒張[25]，此外，冰片具有比較強的NO生物活性，其可以通過硝酸鹽（NO3?）還原到亞硝酸鹽（NO2?），再從NO2?還原到NO的補充途徑（NO3?→NO2?→NO）產生NO，從而發揮對心血管的良好保護與治療作用[26]。本研究發現黃芩素、冰片及其不同比例配伍對基礎狀態的腦基底血管環張力無明顯影響，但能明顯舒張由ET-1、U46619和5-HT預收縮的腦基底血管環，且在高劑量時，黃芩素-冰片（1∶3）對ET-1、U46619預收血管環的舒張作用具有明顯的優勢。ET-1是目前發現的最強的縮血管物質，對維持基礎血管張力與心血管系統穩態起重要作用[27]。內皮細胞在受到刺激時，促進ET-1合成和釋放，主要在基因轉錄水平進行調控[28]，受NO、PGI2、心房利鈉肽及肝素等負調控[29]。U46619是一種強效的TXA2受體激動劑，通過結合細胞膜上TXA2受體產生強烈的收縮血管作用[30]。結果表明黃芩素、冰片及配伍可抑制由ET-1、U46619和5-HT誘發的血管收縮，且黃芩素-冰片（1∶3）的舒張作用優于其余各組，但具體舒張機制尚未明確。

NO是一種具有內皮功能的多效性功能的分子，由內皮細胞中的-精氨酸在鈣-鈣調蛋白依賴性的一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化下合成釋放[31]。而NOS有3種亞型，即在正常狀態下表達的神經元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）和eNOS以及在損傷后誘導表達的iNOS[32]。其中來源于iNOS和nNOS的NO具有神經毒性作用，來源于eNOS的NO具有神經保護作用[33]。eNOS和iNOS是催化NO生成的關鍵酶，其通過在分子水平上調控NO的合成進而參與機體內多種生理活動[34]。而體內iNOS與eNOS之間表達水平的平衡可能是維持血管正常生理功能所必需[35]。目前已知的NOS催化-精氨酸所需要的輔助因子包括氧、NADPH和四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）[36]，NO合成后，由內皮細胞透膜分布到血管平滑肌細胞，激活鳥苷酸環化酶，將鳥苷三磷酸轉化為環磷酸鳥苷，最終導致Ca2+超極化，細胞松弛、血管舒張[37]。腦缺血發生后的短期內，腦組織的氧糖供應迅速減少，致剪切應力的變化和ROS的產生[38]，ROS的蓄積一方面直接刺激內皮細胞，降低了內皮細胞對NO的生物利用率，并誘導其分泌功能紊亂或從平滑肌脫落、結構破壞[39]。另一方面會引起BH4水平不足，導致eNOS脫偶聯，影響對NO的調控，eNOS會和O2?發生反應（O2?由NADPH產生）生成過氧亞硝基（ONOO?），而不是NO，最終發展為內皮細胞功能障礙[40]。因此，NO介導的血管舒張功能受損是促成血管功能障礙的一個重要因素，NO濃度的變化可作為判斷腦梗死預后的重要指標[41]。本研究中，模型組大鼠腦基底動脈內皮損傷嚴重、斷裂，eNOS表達顯著降低、iNOS表達顯著升高，缺血側皮層中NO水平顯著降低、CD34表達升高，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高，TGF-β水平降低；而黃芩素-冰片能不同程度改善腦基底動脈內皮狀態，升高動脈中eNOS、缺血側皮層中CD34、NO和血清中TGF-β表達，下調腦基底動脈中iNOS表達和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，維持eNOS/iNOS的動態平衡，發揮抑制炎癥、保護血管內皮作用。

本研究尚存在不足之處：①只考察了對黃芩素、冰片及其配伍對離體預收縮血管環的舒張作用，并未對具體舒張機制進行探討，也未對MCAO模型大鼠腦基底的舒縮功能進行檢測。②黃芩素、冰片及配伍組只在高濃度時才展現出較好的舒張血管作用，但在考察其對基礎狀態的血管環張力的影響時，雖未體現出明顯的舒張作用，但在高濃度時也表現出了有舒張的血管的趨勢，在此，沒有明確該作用是由于藥物在高濃度時對血管環的毒性所引起的，還是由于藥物本身的舒張作用引發的。③大鼠腦基底動脈由于極細，在穿鋼絲時，極易損傷血管環內皮，影響藥物對血管張力的作用。④只初步對黃芩素-冰片在體藥效進行了評價，而未深入探究具體機制。

綜上，本研究通過離體肌張力描記技術考察了黃芩素、冰片及其配伍對基礎狀態和ET-1、U46619和5-HT預收縮腦基底血管環的舒張作用篩選出最佳比例——黃芩素-冰片（1∶3），通過體內動物學實驗考察了其最佳比例對MCAO模型大鼠的神經功能評分、腦梗死體積、缺血側皮層中CD34和NO表達、血清中炎癥因子水平、腦基底血管內皮狀態、eNOS和iNOS表達的影響，推測黃芩素-冰片可抑制過度炎性反應，上調缺血后微血管eNOS表達，下調iNOS表達，促進NO合成和分泌，提高機體對NO的利用率，發揮抗缺血區微血管內皮功能障礙和促進恢復，改善微循環，減輕神經損傷的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of baicalein-borneol on endothelial dysfunction after cerebral ischemia

HE Yi-fan1, ZHANG Hang-hang1, 2, TANG Chang-jie1, CHEN Xu1, YA Zhuang-ju1, ZHOU Zi-ye1, WANG Bin1, HAN Chao-jun1, LIU Ji-ping1, SHI Yong-heng1

1. School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 2. Shangluo Traditional Chinese Medicine Hospital, Shangluo 726000, China

To explore the effect and mechanism of baicalein, borneol and their combination on tension of cerebral basal vessels and their anti-endothelial dysfunction after cerebral ischemia.vascular ring experiments was used to investigate the effects of cumulative concentrations of baicalein, borneol and different proportions of compatibility on tension of cerebral basal vascular ring pre-contracted by endothelin-1 (ET-1), thromboxane A2analog (U46619) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in resting state. A model of focal cerebral ischemia was constructed by thread occlusion method, different proportions of baicalein-borneol was given, neurological function score was performed; 2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride (TTC) staining was used to observe the volume of cerebral infarction; Fluorescence staining was used to observe the expression of CD34 in ischemic cortex; Level of nitric oxide (NO) in ischemic cortex was detected; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the endothelial integrity of cerebral basal artery; Western blotting was used to detect the expressions of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in basal artery of the brain; ELISA method was used to detect the levels of inflammatory factors in serum.The combination of baicalein, borneol and various proportions had no significant effect on basal vascular ring tension, but could significantly relax the brain basal vascular ring pre-contracted by ET-1, U46619 and 5-HT (< 0.05, 0.01). As the concentration increased, baicalein-borneol (1∶3) had a significant advantage in the relaxation effect of ET-1, U46619 pre-contracted vascular rings. After middle cerebral artery occlusion (MCAO) surgery, the neurological function score of rats was significantly increased (< 0.01). After 24 h of drug intervention, the neurological function score was decreased to varying degrees (< 0.01); Compared with sham group, cerebral infarction rate of rats in model group was significantly increased (< 0.01), endothelial damage and rupture of cerebral basal artery were severe, eNOS expression was significantly decreased (< 0.05), iNOS expression was significantly increased (< 0.01), CD34 expression in ischemic cortex was increased (< 0.01), NO level was significantly reduced (< 0.01), levels of interleukin-1β (IL-1β), IL-6 and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum were significantly increased (< 0.01), transforming growth factor-β (TGF-β) level was significantly decreased (< 0.01); Baicalein-borneol could significantly reduce the cerebral infarction rate to varying degrees (< 0.01), improve the endothelial status of basal artery, increase the expressions of eNOS in arteries, NO and CD34 in ischemic cortex and TGF-β in serum (< 0.05, 0.01), down-regulate iNOS expression in basal artery of brain and IL-1β, IL-6, TNF- α in serum (< 0.05, 0.01).Baicalein, borneol and their combination can inhibit vasoconstriction induced by ET-1, U46619 and 5-HT, and the relaxation effect of baicalein-borneol (1∶3) is superior to other groups. It can inhibit excessive inflammatory response, upregulate the expression of eNOS in microvessels after ischemia, down-regulate the expression of iNOS, promote NO synthesis and secretion, and play a role in combating microvascular endothelial dysfunction and promoting recovery in ischemic areas, improving microcirculation and reducing nerve damage.

cerebral ischemia; baicalein; borneol; endothelial dysfunction; vascular ring

R285.5

A

0253 - 2670(2023)22 - 7455 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.022

2023-08-06

陜西省教育廳專項科研計劃項目（21JK0608）；陜西省中醫藥管理局中醫藥科研項目（2021-ZZ-JC023）

賀一凡（1999—），女，碩士研究生，研究方向為心腦血管藥理學。

通信作者：史永恒，副教授，博士。E-mail: yhshi@sntcm.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]