基于“質-量”雙標的丹參質量分析方法研究

丁昕瑤，包永睿, 2, 3，王 帥, 2, 3，李天嬌, 2, 3，孟憲生, 2, 3*

基于“質-量”雙標的丹參質量分析方法研究

丁昕瑤1，包永睿1, 2, 3，王 帥1, 2, 3，李天嬌1, 2, 3，孟憲生1, 2, 3*

1. 遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600 2. 遼寧省中藥多維分析專業技術創新中心，遼寧 大連 116600 3. 遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600

建立以對照藥材為基準物質的定性和不依賴多種對照品定量的丹參藥材“質-量”雙標控制方法。采用HPLC法，以對照藥材為基準物質建立丹參特征圖譜，通過四極桿-飛行時間質譜（quadrupole-time of flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）技術鑒定共有峰的化學成分，以對照藥材和供試藥材特征峰的相似度，明確藥材真偽，即“質”；對內標成分丹酚酸B進行準確定量，以內標成分計，計算不同批次供試品中各特征峰的相對含量，取“平均數－標準差”作為特征峰化學成分相對于內標物質化學成分的相對含量下限，依據特征峰相對含量下限明確枳殼藥材優劣，即“量”。建立的特征圖譜及含量測定方法符合方法學考察要求；確定了6個共有色譜峰，分別為迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA，各供試藥材與對照藥材的相似度均大于0.90；確定了丹參藥材特征峰化學成分相對含量下限。該方法不依賴多種對照品，能清晰、快速地判斷藥材的真偽優劣，為丹參的質量控制提供參考。

丹參；“質-量”雙標；對照藥材；質量控制；特征圖譜；丹酚酸B；迷迭香酸；紫草酸；隱丹參酮；丹參酮I；丹參酮IIA

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Bge.的干燥根及根莖[1]。丹參藥材廣泛分布于我國華北、華東、中南和西北諸省，各地氣候條件及生長環境不同，導致各地丹參藥材在質量上存在著很大差異[2]。丹參富含多種有效成分，如丹參酮類、丹酚酸類等[3]。近年來的研究表明，丹參及其有效成分有抗腫瘤、抗血栓、抗炎、護肝等作用[4]。目前，丹參藥材質量控制方法主要包括單指標含量測定法及指紋圖譜與含量測定結合法，以上方法具有靈敏度高、重復性好的優點。而整體評價丹參藥材優劣，需依賴多種對照品比對，但消耗量大、步驟繁瑣，且某些指標成分不能反映藥效；指紋圖譜只能模糊地評價藥材相似性不能清晰地判斷供試品真偽優劣的不足。而中藥復雜體系質量評控技術難度和高額成本給中藥企業帶來了巨大的壓力，因此對中藥臨床合理用藥和臨床療效提升的指導和支持作用一直難以體現。

為彌補以上方法的不足，本研究提出了丹參藥材的“質-量”雙標控制方法，緊扣中藥多成分、多功效和整合作用的質量內涵和特點，其指標為能夠反映其藥效的化學成分；采用1種內標物質對特征峰化學成分進行相對定量，盡可能控制供試藥材有效化學成分含量同時，不需要大量購買對照品，在滿足中藥化學成分“整體性”與“清晰性”的同時減輕了中藥復雜體系質量評控成本。本方法以對照藥材為基準物質構建特征圖譜，并以可代表丹參藥效的有限個代表性成分作為特征峰，評價對照藥材和供試藥材特征峰的相似度，用于判斷丹參的真偽；選用保留時間穩定且價格低廉、易獲得的內標物質作為定量評價指標，開展基于內標物質的特征峰化學成分相對定量研究，通過內標物質化學成分準確定量，計算供試藥材特征峰化學成分的相對含量，用于判斷丹參的優劣。基于“質-量”雙標的丹參質量分析方法可有效解決丹參有效成分同時快速測定和中藥復雜體系質量評控成本高的問題。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HS6150型超聲波清洗器（天津恒奧科技發展有限公司）；ME55十萬分之一電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜儀、Agilent 6550 Q-TOF-MS質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料

丹參對照藥材（批號120989-201705，中國食品藥品檢定研究院）。10批丹參供試藥材來源及批號信息見表1，經遼寧中醫藥大學張慧教授鑒定為唇形科植物Bge.的根及根莖。丹酚酸B對照品（經HPLC檢測質量分數≥96.1%，批號111562-201917）由中國食品藥品檢定研究所提供。乙腈（質譜級，德國Merck公司）；水（純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司）。

表1 丹參來源及批號信息

2 方法與結果

2.1 基于丹參對照藥材的特征圖譜建立

2.1.1 溶液的制備 取丹參對照藥材粉末（過4號篩）0.50 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質量，超聲30 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足失重，搖勻，濾過揮干，80%甲醇定容至10 mL量瓶，搖勻，過0.22 μm濾膜，續濾液作為參照物溶液。取丹參供試藥材粉末（過4號篩）0.50 g，按上述方法制成供試品溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），流動相為水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～5 min，15%～25% B；5～10 min，25% B；10～12 min，25%～35% B；12～20 min，35%～48% B；20～30 min，48%～55% B；30～35 min，55% B；35～40 min，55%～56% B；體積流量0.6 mL/min；柱溫30 ℃，DAD檢測波長280 nm，進樣量5 μL。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液5 μL，按“2.1.2”項色譜條件測定，連續進樣6次，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算RSD。各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD在0.9%～1.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液5 μL，按“2.1.2”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進樣6次，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算RSD。各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD在2.1%～2.3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.5 重復性試驗 按供試品溶液制備方法制備6份供試樣品，按“2.1.2”項色譜條件分別進樣檢測，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算RSD。各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD在1.6%～1.7%，表明方法重復性良好。

2.1.6 特征圖譜的建立 將參照物溶液和供試品溶液，每份樣品平行2次，按色譜條件依次進樣檢測，將280 nm波長下的圖譜數據由分析檢測儀器中導入中國藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價軟件”（2012.130727版本），獲得10批丹參藥材的HPLC特征疊加圖譜，見圖1。以丹參對照藥材的圖譜為參照譜圖，使用中位數進行自動匹配，加以多點校正，共標定6個共有峰，其中3號峰穩定性、重復性、分離度好、位置居中，故以其作為參照峰（S）；將共有模式與對照藥材特征圖譜進行比對，見圖2。供試品色譜在相應位置呈現6個特征峰，并與對照藥材色譜圖中的6個特征峰保留時間相對應，見表2。

2.2 相似度評價

以丹參對照藥材和供試藥材特征峰的相似度明確丹參藥材真偽。采用中國藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價軟件”（2012.130727版本）進行數據處理，利用夾角余弦法計算供試品與對照藥材特征圖譜的相似度應不得低于0.90。丹參供試藥材與丹參對照藥材的相似度均大于0.96，說明本研究所收集的丹參供試藥材的特征峰化學成分基本一致，質量相對穩定[5-6]，相似度結果見表3。

圖1 10批丹參供試藥材的HPLC疊加圖譜

圖2 丹參對照藥材特征圖譜及供試藥材共有模式

表2 特征峰保留時間及相對保留時間

表3 丹參供試藥材相似度評價

2.3 特征峰化學成分解析

在初步采用Agilent-1260Ⅱ高效液相色譜儀利用相對保留時間與對照品比對的基礎上，采用Agilent 6550 Q-TOF-MS質譜儀，進行質譜分析，運用Agilent MassHunter Qualitative Analysis軟件，通過對照品比對的方法對正、負離子模式進行化學成分解析，進一步明確特征峰所代表的化學成分。

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～5 min，15%～25% B；5～10 min，25% B；10～12 min，25%～35% B；12～20 min，35%～48% B；20～30 min，48%～55% B；30～35 min，55% B；35～49 min，55%～56% B；體積流量0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源（Dual AJS ESI），正、負離子模式，毛細管電壓（Vcap）為3500 V，干燥氣體體積流量為11 L/min，干燥氣體溫度為150 ℃，霧化器壓力為172.4 kPa，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣體積流量為10 L/min，質量掃描范圍/100～1000。

采用auto MS/MS模式，利用對照品比對及數據庫查詢等方法對特征峰化學成分進行解析。正、負離子模式鑒定出了6個特征峰所代表的化學成分，見圖3。其中，1號峰為迷迭香酸、2號峰為紫草酸、3號峰為丹酚酸B、4號峰為隱丹參酮、5號峰為丹參酮I、6號峰為丹參酮IIA，鑒定結果見表4。

1-迷迭香酸 2-紫草酸 3-丹酚酸B 4-隱丹參酮 5-丹參酮I 6-丹參酮IIA

表4 丹參藥材特征峰的UPLC-Q-TOF-MS鑒定

2.4 基于內標物質的特征峰化學成分相對定量研究

丹酚酸B（3號峰）為《中國藥典》2020年版中丹參“含量測定”項下的指標成分之一，該峰分離效果好、峰面積大、保留時間穩定、對照品價格低廉，故以其作為內標物質，開展基于內標物質的特征峰化學成分相對定量研究。

2.4.1 線性關系考察 配制丹酚酸B的6個不同質量濃度溶液，按“2.1.2”項下色譜條件，分別進樣檢測，以質量（）為橫坐標，峰面積（）為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，得到線性回歸方程＝1 767.0－6.498 9，＝1.000 0，線性范圍0.906 6～1.976 0 μg。結果表明進樣量范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4.2 精密度試驗 取同一對照品溶液，按“2.1.2”項色譜條件連續進樣6次，測定丹酚酸B峰面積的RSD為1.26%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1.2”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測定丹酚酸B峰面積的RSD為2.14%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取同一供試品藥材粉末6份，按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.2”項色譜條件測定峰面積，計算丹酚酸B質量分數的RSD為2.62%，表明方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱定丹參藥材粉末6 份，分別精密加入丹酚酸B對照品適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件，分別進樣檢測，計算得到丹酚酸B的平均加樣回收率為99.45%，RSD為1.25%。

2.4.6 耐用性試驗 精密吸取同一供試品溶液，考察不同規格的色譜柱（Agilent poroshell 120 SB-C18、Agilent poroshell 120 EC-C18）、不同的高效液相色譜儀（Agilent-1260Ⅱ高效液相色譜儀、Agilent-1290型高效液相色譜儀）、不同柱溫（25、30、35 ℃）及不同體積流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）對檢測結果的影響。結果顯示，指認出的6個化學成分的相對保留時間的RSD均小于2.89%，相對峰面積的RSD均小于2.0%～2.1%，表明該方法的耐用性良好。

2.4.7 相對含量測定 取丹參供試品藥材，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件分析測定丹酚酸B含量，每個供試品平行2份，結果見表5。每個供試品中特征峰化學成分的相對含量計算方法：特征峰化學成分相對含量＝特征峰峰面積×(丹酚酸B含量/丹酚酸B峰面積)，結果見表6。以“平均數－標準差”作為特征峰化學成分相對于內標物質的相對含量下限，根據此方法測得的供試藥材特征峰化學成分相對含量不應低于該含量下限[13]。

表5 內標物質丹酚酸B的準確定量結果(n =2)

特征峰化學成分相對含量＝特征峰峰面積×(丹酚酸B含量/丹酚酸B峰面積) 相對含量下限＝平均數－標準差

Relative content of characteristic peak chemical composition = characteristic peak area × (salvianolic acid B content/salvianolic acid B peak area) lower limit of relative content = mean－standard deviation

3 討論

中藥化學成分復雜、品種來源寬泛，導致中藥質量良莠不齊。而市面上偽品同時作為丹參入藥，容易造成鑒別困難與臨床用藥混亂的現象，影響中藥丹參的臨床合理使用。目前，中藥材（飲片）質量控制方法存在著單一指標不能反映藥材整體特征且依賴于多種對照品，而指紋圖譜只能模糊地評價藥材相似性，不能清晰地判斷供試品真偽優劣[12]。

為解決上述問題，本研究創新研究思路，提出不依賴多種對照品，以價格低廉、易獲得的對照藥材為基準物質的定性和不依賴多種對照品定量的丹參藥材“質-量”雙標控制方法。通過構建丹參對照藥材及10個不同產地丹參供試藥材的特征圖譜，以對照藥材為基準物質，評價對照藥材和供試藥材特征峰的相似度，判斷丹參藥材的真偽，即“質”；同時準確定量1種內標物質化學成分，計算丹參藥材其余各特征峰的相對含量，通過確定各特征峰相對含量的下限來判斷丹參藥材優劣，即“量”。本研究所提出的丹參藥材的“質-量”控制方法能夠有效判斷藥材的真偽優劣，形成一個科學、可控的中藥質量控制體系。

本研究以信噪比大于10、分離度大于1.5作為特征峰的選取依據。采用質譜聯用技術指認出6個化學成分。丹參酮I可通過抑制基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和MMP-9的表達以及Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/ 核因子抑制蛋白-α（inhibitor kappa B alpha，IκBα）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路，調控腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β等炎癥因子的釋放而發揮抗炎活性[14]。丹參酮ⅡA聯合癌易感性候選基因2（cancer susceptibility candidate 2，CASC2）可以抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，以及誘導細胞凋亡[15]；隱丹參酮通過抑制腦膠質瘤GL261細胞的增殖發揮抗腦膠質瘤作用[16]；丹酚酚B可通過Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路抑制胸主動脈瘤的發生發展，并改善免疫功能、炎性反應及氧化應激狀態[17]。上述研究結果與丹參治療心腦血管疾病、抗炎、抗腫瘤等功效相關，從而進一步證明本方法特征峰的選擇能夠較科學地闡述丹參的藥效。

4 結論

本研究所收集的丹參供試藥材與丹參對照藥材的相似度均大于0.90[18]，說明所收集的丹參供試藥材的特征峰化學成分基本一致，但僅采用10批不同產地的藥材規定特征峰相對含量下限，缺乏全面性，因此，需要更進一步大量收集不同產地、不同批次的藥材，完善該方法，以期有效判斷藥材的真偽優劣，形成一個科學、可控的中藥質量控制體系，在滿足藥材多項質量控制項的同時減輕企業需大量購買對照品的經濟壓力，推動中醫藥事業可持續發展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on quality analysis method ofetbased on “quality-quantity” double standard

DING Xin-yao1, BAO Yong-rui1, 2, 3, WANG Shuai1, 2, 3,LI Tian-jiao1, 2, 3, MENG Xian-sheng1, 2, 3

1. College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China 2. Liaoning Multi-dimensional Analysis of Traditional Chinese Medicine Technical Innovation Center, Dalian 116600, China 3. Liaoning Modern Traditional Chinese Medicine Research and Engineering Laboratory, Dalian 116600, China

To establish a “quality-quantity” double standard control method for Danshen (et), which was qualitative based on the reference traditional Chinese medicinal materials (TCMM) as standard substances and quantified without relying on multiple reference substances.HPLC technology was used to establish the characteristic chromatogram ofetbased on the reference TCMM as standard substances. The chemical constituents of common peaks were identified by quadrupole-time of flight mass spectrometry (Q-TOF-MS) technology, and the authenticity ofetwas determined by the similarity of characteristic peaks of the reference TCMM and the tested TCMM. The above statement is “quality”. The relative content of each characteristic peak in different batches of the tested TCMM was calculated by accurate quantition of internal standard component salvianolic acid B. The “average value－standard deviation” was taken as the lower limit of the relative content of characteristic peak chemical components relative to chemical composition of internal standard substance, and the merits ofetwas determined according to the lower limit of the relative content of characteristic peak. The above statement is “quantity”.The characteristic chromatogram and content determination method met the requirements of methodology investigation. A total of six common chromatographic peaks were determined, which were rosmarinic acid, alkannic acid, salvianolic acid B, cryptotanshinone, tanshinone I, tanshinone IIA. The similarity between the tested TCMM and reference TCMM was greater than 0.90. The lower limit of relative content of chemical components ofetcharacteristic peak was defined.The method can judge the authenticity of medicinal materials clearly and quickly without many reference substances, and provide reference for quality control ofet.

et; “quality-quantity” double standard; reference traditional Chinese medicinal materials; quality control; characteristic chromatogram; salvianolic acid B; rosmarinic acid; alkannic acid; cryptotanshinone; tanshinone I; tanshinone IIA

R286.02

A

0253 - 2670(2023)22 - 7287 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.002

2023-05-10

遼寧省教育廳創新團隊項目（LT2017015）

丁昕瑤，女，研究生，主要從事藥物分析研究。Tel: 15140621102 E-mail: dxy07172021@163.com

通信作者：孟憲生，男，博士生導師，主要從事藥效物質組學和作用機制整合研究。E-mail: mxsvvv@126.com

[責任編輯 潘明佳]