硒化合物對乙醇代謝物損傷的間充質干細胞體外增殖的影響

陳 鳳,徐曉敏,吳豐勇,王 菲

(中山大學附屬第七醫院消化醫學中心,廣東深圳 518107)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有來源廣泛、免疫原性低、分泌大量細胞因子抑制炎性反應,以及分化成各種細胞的能力[1],在多種組織器官再生中具有巨大潛力,如肝臟、腎臟、神經、心臟、骨及皮膚再生等[2-3]。研究發現損傷部位普遍存在的促炎癥和促氧化的宿主環境,大大降低了移植細胞的存活率,較大程度限制了MSCs的臨床應用[4]。硒化合物具有很強的抗氧化作用,研究已證實硒在人體中具有清除自由基、抵抗有害重金屬、免疫調節、保護肝臟等器官的重要作用[5]。有研究報道乙醇及其代謝物誘導的氧化損傷環境會破壞干細胞DNA[6]。因此,本研究擬通過在體外模擬乙醇代謝過程中形成的乙醇代謝產物誘導氧化應激環境來分析硒化合物對MSCs體外增殖的影響。乙醇進入細胞后主要在乙醇脫氫酶和細胞色素酶P450作用下氧化分解為乙醛,后者在乙醛脫氫酶作用下氧化為乙酸,這些乙醇代謝物可通過脂質過氧化破壞線粒體膜和細胞膜,造成細胞損傷[7]。至今尚未見有關于硒化合物在乙醇代謝過程中如何影響MSCs體外增殖的報道。因此本研究選取硒甲基硒代半胱氨酸(Se-methylselenocysteine hydrochloride,Se-c)、依布硒啉(Ebselen,Eb)、硒代蛋氨酸(Selenomethionine,Se-M)3種硒化合物,分析它們對乙醇、乙醛、乙酸損傷的人脂肪MSCs(human adipose mesenchymal stem cells,hADSCs)和人臍帶MSCs(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUMSCs)體外增殖的影響,為提高干細胞移植治療后的抗應激能力奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

hADSCs和hUMSCs購自賽業生物科技有限公司,高糖DMEM培養基、胎牛血清、青-鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA(0.25%)、二甲基亞砜(DMSO)購自Gibco公司,Se-c(M6680)和Se-M (S3132)購自Sigma公司,Eb (70530)購自Cayman公司,乙醇、乙醛、乙酸溶液均購自Aladdin公司,CellTiter-Glo?發光法細胞活力檢測試劑盒購自Promega公司,本實驗中細胞正常培養液為高糖DMEM培養基+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1細胞活力測定

采用CellTiter-Glo?發光法細胞活力檢測試劑盒進行測定,使用時將緩沖液與底物瓶混勻,96孔板細胞中每孔加入50 μL的CellTiter-Glo混合試劑,隨后將孔板放入定軌搖床中,90 rpm混合內容物2 min誘導細胞裂解;將平板室溫孵育10 min使熒光信號穩定,在酶標儀化學發光選項中讀取560 nm處的熒光信號值。

1.2.2乙醇代謝物誘導MSCs損傷的半數抑制濃度(IC50)值測定

將傳代培養至P4的hADSCs和hUMSCs按照每孔2 000個細胞的密度接種于96孔板中,24 h后去除原培養液,分別加入使用細胞培養液稀釋為不同濃度的乙醇、乙醛和乙酸溶液。乙醇依次稀釋為1 600、800、400、200、100、50、25、10、0 mmol/L,乙醛依次稀釋為40、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0 mmol/L,乙酸依次稀釋為250、200、150、100、75、50、25、10、5、2、0 mmol/L;每個濃度設置5個重復孔,在乙醇代謝物作用于細胞24 h后進行細胞活力檢測,根據IC50值建立細胞氧化應激模型。

1.2.3硒化合物對MSCs增殖活力的影響

根據操作說明書將3種硒化合物稀釋為儲存濃度進行保存,同上進行細胞鋪板后,分別加入依次稀釋為10、5、2、1、0.5、0.25、0.1、0.01、0 μmol/L濃度的3種硒化合物,于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h后進行細胞活力檢測。基于相關文獻[8-9]的報道及實驗結果,分別選取1 μmol/L和3 μmol/L濃度的Se-c、Eb、Se-M用于后續的研究。

1.2.4硒化合物對乙醇代謝物損傷的MSCs增殖活力的影響

同上操作,將細胞接種在96孔板中, 分別加入1 μmol/L和3 μmol/L濃度的3種硒化合物溶液,繼續培養24 h后將培養液更換為含有相應濃度硒化合物和不同乙醇代謝物的培養液,24 h后檢測細胞活力。其中空白對照組加入等量的細胞培養液,實驗對照組使用乙醇代謝物(不含硒化合物)進行預處理。

1.3 統計學處理

采用SPSS26.0統計軟件進行數據分析,多組間的比較先采用單因素方差分析,如果組間差異有統計學意義,進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 乙醇代謝物作用于MSCs的IC50值測定

乙醇代謝物作用于不同MSCs的IC50值測定結果如圖1所示,乙醇、乙醛、乙酸誘導hADSCs和hUMSCs損傷的IC50值分別為230.2 mmol/L和199.9、1.32 mmol/L和1.30、24.21 mmol/L和18.66 mmol/L。

圖1 乙醇代謝物作用于hADSCs和hUMSCs的IC50值測定

2.2 硒化合物對不同MSCs增殖活力的影響

分別添加不同濃度的Se-c、Eb、Se-M至hADSCs和hUMSCs中檢測細胞增殖活性的變化。結果顯示在hADSCs中,0.5～10.0 μmol/L的 Se-c、0.1～2.0 μmol/L的Eb、0.5～2.0 μmol/L的Se-M相較對照組均能明顯提高細胞活力(P<0.05),見圖2A～C。在hUMSCs中,0.1～10.0 μmol/L的Se-c、0.1～1.0 μmol/L的Eb、0.25～5.0 μmol/L的Se-M相比對照組的細胞增殖活性均有明顯提高(P<0.05),見圖2D～F。

A～C:hADSCs;D～F:hUMSCs;a：P<0.05。

2.3 硒化合物對乙醇代謝物損傷的MSCs增殖活力的影響

硒化合物預處理后檢測乙醇代謝物損傷的MSCs增殖活性的改變,見圖3。與空白對照組相比,乙醇、乙醛、乙酸處理組均明顯降低了兩種細胞的增殖活性(P<0.05);與實驗對照組相比,1 μmol/L和3 μmol/L的Se-c、Eb、Se-M能有效提高乙醇損傷后的hADSCs增殖活力,其中3 μmol/L Eb和1 μmol/L Se-M組的細胞活性明顯高于1 μmol/L Eb組和3 μmol/L Se-M組(P<0.05);在乙醛損傷hADSCs的研究中,只有Se-c和Eb可以提高損傷后的細胞活力,且1 μmol/L Eb組的改善效果較3 μmol/L Eb組明顯(P<0.05)。3種硒化合物均對乙酸損傷后的細胞活性沒有改善作用,反而更進一步降低了細胞活力。此外,與實驗對照組相比,只有3 μmol/L Se-c和Se-M組明顯提高了乙醇處理后的hUMSCs活性,3 μmol/L Se-c、Eb和Se-M明顯改善了乙醛損傷后的hUMSCs活性(P<0.05)。

A～C:hADSCs;D～F:hUMSCs;①:空白對照組;②:實驗對照組;③:1 μmol/L Se-c組;④:3 μmol/L Se-c組;⑤:1 μmol/L Eb組;⑥:3 μmol/L Eb組;⑦:1 μmol/L Se-M組;⑧:3 μmol/L Se-M組;a：P<0.05,與①比較;b：P<0.05,與②比較;c：P<0.05,與相同硒化合物(1 μmol/L)比較。

2.4 不同硒化合物對乙醇代謝物損傷的MSCs增殖活力的影響比較

進一步對3種硒化合物在乙醇和乙醛損傷的MSCs的增殖活力進行比較分析,結果見圖4。在乙醇損傷hADSCs中, 3 μmol/L Eb組的細胞活力明顯高于其他硒化合物組(P<0.05);在乙醛損傷hADSCs中,1 μmol/L Eb組的細胞活力最高,與3 μmol/L Se-M組差異無統計學意義(P>0.05),但明顯高于其他組(P<0.05)。在乙醇損傷hUMSCs中,3 μmol/L Se-c和1 μmol/L Se-M改善細胞活力的效果最好,3 μmol/L Se-M在乙醛損傷hUMSCs中的細胞活力最高,明顯高于Se-c和1 μmol/L Eb組(P<0.05),但與3 μmol/L Eb和1 μmol/L Se-M組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

A～B:hADSCs;C～D:hUMSCs;①:1 μmol/L Se-c組;②:3 μmol/L Se-c組;③:1 μmol/L Eb組;④:3 μmol/L Eb組;⑤:1 μmol/L Se-M組;⑥:3 μmol/L Se-M組;a：P<0.05。

3 討 論

通過增強MSCs的抗應激能力對各種疾病的治療效果有積極影響,研究表明基因修飾、預處理和優化培養條件是提高MSCs體內外功能的關鍵策略,預處理能夠提高MSCs的細胞活力、旁分泌效應、分化效能以及進入損傷部位的歸巢能力等[10]。硒最重要的生物學效應就是抗氧化作用,研究顯示硒在羊水MSCs的體外擴增和多能性維持方面發揮著關鍵作用,通過激活ERK1/2、AKT、NF-κB等信號通路增強了細胞的增殖遷移能力以及促進了體內傷口的愈合[11]。但是截至目前,關于硒化合物對脂肪和臍帶來源MSCs在體外培養過程中的影響尚不清楚,因此本研究旨在以硒化合物為中心探討其對乙醇代謝損傷MSCs的影響,以期為促進再生醫學的發展提供實驗依據和理論基礎。

本研究結果顯示3種乙醇代謝物在hADSCs的IC50值均分別高于hUMSCs,表明它們誘導hUMSCs損傷的作用更強,側面也反映hADSCs在乙醇暴露情況下的抗應激能力更高,可能與hADSCs在體外耐受細胞凋亡的能力更強有關[12],項目組前期開展的研究也表明hADSCs具備更強的增殖能力[13]。進一步的研究結果顯示適宜濃度的硒化合物能夠促進MSCs的增殖,小于10 μmol/L的Se-c以及小于2 μmol/L的Eb和Se-M可提高細胞活力。在Shi等人分析硒對體外培養的精原干細胞的增殖和凋亡研究中,發現2 μmol/L硒可通過抑制活性氧的產生、調節細胞周期和凋亡相關基因的表達來促進細胞的增殖,然而高濃度的硒化合物(8 μmol/L和16 μmol/L)會促進細胞的凋亡[9]。另一項研究也表明在凍融培養基中添加5 ng/mL硒可提高細胞中Bcl-2的表達和抗凋亡作用[14]。此外,5 ng/mL硒可以增強hADSCs來源外泌體的活性,減少炎癥,促進增殖和遷移,最終導致傷口的愈合[15]。本研究表明硒化合物可改善乙醇和乙醛損傷的MSCs活力,但在乙酸作用下無效,反而會降低細胞活力,可能是由于硒化合物與乙酸相互作用形成的產物進一步損傷細胞所致。有研究表明,補充硒可緩解乙醇引起的氧化應激,加速乙醇代謝,減少肝細胞損傷等[16-17]。因此如果采用硒預處理生長在乙醇暴露微環境下的細胞,建議在乙醇暴露前或更早的時期開始添加。本研究中Eb在hADSCs以及Se-M在hUMSCs中發揮的效果最好,目前已有較多研究證實二者在人體多個系統的疾病治療中具有優良的潛在應用前景[18-19],但本實驗尚未對硒化合物是否會對MSCs產生其他不利影響進行分析,其最終的效果及機制有待進一步確認。

綜上所述,適宜濃度的硒化合物可用于提高乙醇暴露即乙醇和乙醛誘導損傷的MSCs活力,其中Eb用于改善hADSCs以及Se-M用于hUMSCs的效果最好。但采用硒或者其他化合物對細胞進行預處理的適用劑量、是否會對細胞產生不利影響、預處理后細胞移植的成瘤性,以及是否存在其他協同促進的因素等問題還需要更多的研究來闡明,這些問題的解決將會促進再生醫學的進一步發展。