松蘿提取物對膠原誘導性關節炎大鼠HMGB1-RAGE通路及自噬相關基因的影響

趙青青,安 陽,張 軍,徐 暉,陸道敏,曹躍朋,寧喬怡,王 瑩

(1.貴州中醫藥大學,貴陽 550001;2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院風濕免疫科,貴陽 550001)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,其主要病理改變在滑膜組織,以對稱性、破壞性關節炎為特征,致殘率高[1]。滑膜細胞自噬參與了RA關節的炎癥與損壞,高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein,HMGB1)是重要的細胞自噬調節基因,近年來研究認為其與高親和力受體也就是晚期糖基化終產物受體(the receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)結合,促進滑膜成纖維細胞(synovialfibroblast,SF)遷移、增殖和分化,進而導致關節破壞和功能喪失[2]。研究證實,HMGB1-RAGE可以激活死亡相關蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)促使Beclin1磷酸化,誘導Beclin1與B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)分離,調節細胞自噬[3],調控關節炎癥。

侗藥松蘿性味甘、平,有除濕通絡、清熱解毒之功。有研究證實,松蘿提取物有抗炎、鎮痛、抑制血管生成等作用[4]。課題組在前期的臨床研究中證實松蘿的組方可改善RA患者的臨床癥狀和體征,降低炎癥水平[5]。動物實驗研究顯示,松蘿制劑能減輕膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠關節腫脹,降低滑膜細胞活化核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的蛋白活性[6-7]。本研究探討松蘿提取物對HMGB1-RAGE通路及自噬相關基因的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級Wistar大鼠54只,雌性,5周齡,體重(160±10)g,購自湖北省實驗動物研究中心,許可證號SCXK(鄂)2020-0018,飼養于貴陽中醫學院實驗動物中心。電熱恒溫培養(ICV-450)購自日本ASONE公司;離心機(HI650)購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;HMGB1檢測試劑盒(SEA399Ra)購自武漢優爾生商貿有限公司;QuantiCyto?Rat IL-6 ELISA kit(ERC003.48)購自深圳欣博盛生物科技有限公司;磷酸酶抑制劑(S1873)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)購自上海碧云天生物技術有限公司;Taq Plus DNA Polymerase(ET105-01)購自日本TINGEN公司;松蘿提取物[批號:IU0130,其主要成分為松蘿酸(純度>98%)]、羥氯喹(HCQ,批號:IH0720)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1分組和建模

飼養環境(22±2)℃、濕度約70%,適應性豢養1周啟動實驗。采用隨機數字表法將大鼠分為松蘿提取物低劑量組、松蘿提取物中劑量組、松蘿提取物高劑量組、HCQ組、模型組、空白組[8],每組9只。

牛Ⅱ型膠原放置醋酸(0.1 mol/L)內溶解,充分混合(2 mg/mL溶液),4 ℃冰箱靜置1 d。等量混合弗氏全佐劑同時乳化得到Ⅱ型膠原乳液,向大鼠尾根部注射0.1 mL以誘導炎癥,構建穩定的CIA大鼠模型[9]。有效建模的標準:經由關節炎評分顯示模型大鼠的趾端到踝關節區域見紅腫現象,同時關節炎評分在4分以上[10]。

根據課題組先前的實驗經驗[4]及臨床成人用量(常規15 g、小量6 g、大量120 g)之間的比例,本研究松蘿提取物給藥低劑量為2 mg/kg,中劑量為6 mg/kg,高劑量為54 mg/kg。HCQ成人用量為每天400 mg,根據60 kg成人和動物藥物劑量對應換算系數表,雙方換算系數W=5.4,即大鼠用藥劑量為人用藥劑量的5.4倍[11],由此每只大鼠用藥量為每天36 mg。各組給予相應藥物灌胃,空白組及模型組灌胃等量生理鹽水,每天1次,連續灌胃28 d。

1.2.2樣品采集

待最后1次灌胃結束后2 h,經腹腔注入0.4 mL/100 g氨基甲酸乙酯行麻醉處理,采集5 mL左右的股動脈血液室溫下靜置0.5 h,3 000 r/min離心15 min,提取血清,待后續實驗。處死大鼠,取后右足踝關節,分離出滑膜組織,檢測蛋白水平。

1.2.3ELISA檢測血清致炎因子水平

采集大鼠血液,常規離心,分離血清,ELISA檢測HMGB1、IL-6水平。按照相關試劑盒說明進行操作,37 ℃反應30 min溫育,洗板5次,加入酶標試劑,37 ℃反應,再洗板5次,加入顯色液A、B,37 ℃顯色10 min,加入終止液,酶標儀在450 nm波長處測量吸光度(A)值。

1.2.4RT-PCR檢測Bcl-2、Beclin1和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶(ptdlns3K Class 3,PI3K C3)mRNA表達

完成總RNA的提取和對cDNA的逆轉錄合成。合成條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40個循環。測定Bcl-2、Beclin1、PI3K C3 mRNA表達。引物設計見表1。

表1 Beclin1、Bcl-2、PI3K C3引物序列

1.2.5Western blot檢測HMGB1、RAGE、Beclin1、Bcl-2和PI3K C3蛋白表達

將剪碎的滑膜組織塊勻漿,冰上裂解30 min后,在4 ℃下12 000 r/min離心5 min,取上清液。以BSA為標準,Bradford 法對上清液進行蛋白定量。隨后進行蛋白變性,SDS-PVDF電泳,TBST封閉液浸泡PVDF膜,室溫搖床封閉2 h。一抗4 ℃過夜,二抗孵育2 h,反復洗膜,顯色曝光,分析目的條帶相對灰度值。

1.2.6關節滑膜病理形態學觀察

取關節滑膜組織,4%多聚甲醛溶液,石蠟包埋,常規HE和膠原纖維染色。光鏡下觀察滑膜細胞病理改變,圖像分析系統分析結果。

1.2.7透射電子顯微鏡觀察自噬體情況

將待觀察細胞離心,洗滌,戊二醛、鋨酸固定,丙酮梯度脫水,浸泡,包埋,修塊,定位,切片,染色。在透射電鏡下觀察細胞自噬體和自噬泡的形成。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠關節炎指數和關節腫脹情況

與模型組[(3.50±0.53)分]比較,HCQ組[(1.62±0.74)分]和松蘿提取物中、高劑量組[(2.25±0.88)分、(1.75±0.70)分]關節炎指數降低(P<0.05),關節紅腫情況明顯緩解;與HCQ組比較,松蘿提取物中、高劑量組關節炎指數、紅腫情況無明顯變化(P>0.05),松蘿提取物低劑量組[(3.00±0.75)ng/mL]關節炎指數升高(P<0.05),見圖1。

A:空白組,無關節發紅、腫脹;B:模型組,可見腳趾延續到整個踝關節重度紅腫;C:松蘿提取物低劑量組,可見足爪關節紅腫較模型組稍緩解;D、E、F:分別為松蘿提取物中、高劑量組及HCQ組,可見足爪關節紅腫明顯緩解。

2.2 關節滑膜細胞病理形態學

空白組病理結構正常。模型組可見滑膜細胞明顯增生,并伴有炎性細胞浸潤,血管翳形成。與模型組比較,各劑量松蘿提取物組及HCQ組滑膜細胞增殖程度逐漸減低,滑膜細胞層數減少,排列更整齊,見圖2。

A:空白組;B:模型組;C:松蘿提取物低劑量組;D:松蘿提取物中劑量組;E:松蘿提取物高劑量組;F:HCQ組。

2.3 各組大鼠IL-6、HMGB1水平

與空白組比較,模型組IL-6與HMGB1水平升高(P<0.05);與模型組比較,松蘿提取物低、中、高劑量組、HCQ組HMGB1、IL-6水平降低(P<0.05);與HCQ組比較,松蘿提取物低劑量組HMGB1、IL-6水平升高(P<0.05),松蘿提取物中、高劑量組HMGB1、IL-6水平無明顯變化(P>0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6、HMGB1水平比較

2.4 各組大鼠滑膜組織Beclin1、Bcl-2與PI3K C3 mRNA表達

與空白組比較,松蘿提取物不同劑量組、HCQ組和模型組Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達升高,Beclin1 mRNA表達降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,HCQ組和松蘿提取物中、高劑量組Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達降低,Beclin1 mRNA表達升高(P<0.05);與HCQ組比較,松蘿提取物高、中劑量組上述指標無明顯變化(P>0.05),見表3。

表3 各組大鼠滑膜組織Beclin1、Bcl-2與PI3K C3 mRNA表達比較

2.5 各組大鼠滑膜組織HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3與Beclin1蛋白表達

與空白組比較,模型組HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3蛋白表達升高,Beclin1蛋白表達降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,HCQ組和松蘿提取物中、高劑量組HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3蛋白表達降低,Beclin1蛋白表達升高,差異有統計學意義(P<0.05);與HCQ組比較,松蘿提取物中、高劑量組上述指標無明顯變化(P>0.05),見圖3、表4。

A:空白組;B:模型組;C:松蘿提取物低劑量組;D:松蘿提取物中劑量組;E:松蘿提取物高劑量組;F:HCQ組。

表4 各組大鼠滑膜組織HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3與Beclin1蛋白表達比較

2.6 透射電子顯微鏡觀察自噬體情況

透射電子顯微鏡觀察發現,空白組滑膜組織中細胞線粒體結構完整,有少量自噬體形成,維持正常細胞代謝需求;與空白組比較,模型組細胞線粒體結構完整,數量有所增加,自噬體數量相對較少;與模型組比較,松蘿提取物低劑量組細胞自噬體數量未見明顯異常變化,松蘿提取物中劑量組細胞自噬體數量增加,細胞出現一定固縮,凋亡程度加重,松蘿提取物高劑量組及HCQ組自噬體數量增加更明顯,見圖4。

3 討 論

RA屬于一類尚無確切病因的多因素自身免疫性疾病,侗族醫學屬“水熱病”范疇,主要是由于外感風、寒、濕、熱等邪毒,導致“氣血熱、水火交爭”的變化,致使脈道不通、氣血水津代謝異常,機體蘊生“邪熱”所致,不通則痛,不榮則痛,疼痛乃邪熱蘊阻關節之外像[12]。在病因、病機及治療理論上,侗醫名家吳定元著《草木春秋》系統的描述了風濕病的發病特征,對風濕病提出“趕邪、消水”的診療方法,認為有邪當驅趕,腫脹宜消水。侗藥松蘿性味甘、平,有氣無味而屬陽,主表散、上升,使在表之邪氣得以發散,在內的水濕得以宣發肅降、通調水道,讓水液自流;該藥生于樹顛而下垂,位陽兼有陰的屬性,主里、下降,可通過利水分消在內之邪。具有祛風除濕通絡、消腫止痛、清熱解毒化邪氣之功[13],可治風濕痹痛、跌打損傷。

自噬是一種參與細胞解決應激、修復損傷和維持穩態的重要代謝過程。但過度自噬或持續時間過長,會引起細胞代謝紊亂甚至細胞凋亡[14]。研究表明,自噬在滑膜炎的發生和發展中發揮了重要作用,自噬失調可能導致炎癥反應的加劇和RA發病[15]。HMGB1及其受體RAGE的表達和激活可以促進自噬的發生和早期階段的進展,同時HMGB1還可以通過啟動NF-κB和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等多種信號通路,促進IL-6等炎癥因子的釋放來促進炎癥反應,進而影響自噬的進程[16]。在自噬初期,Beclin1與PI3K C3蛋白結合形成復合物[17],促進磷脂酰肌醇3-磷酸產生,從而促進自噬體形成和成熟。另外,Beclin-1與Bcl-2通過調節線粒體自噬清除病態線粒體等[18],保證細胞代謝的平穩和能量的供應。Brazilin(具有抗炎特性)處理RA滑膜細胞后,LC3-Ⅱ和Beclin1等與自噬相關的蛋白表達升高[19]。此外,用自噬抑制劑如氯喹類處理CIA大鼠模型后,可以有效減輕炎癥反應、減少趨化因子的分泌等[20]。自噬在類風濕炎癥中有重要的作用,調控自噬可能成為治療類風濕疾病的一個重要手段。

本研究結果顯示,與空白組比較,模型組大鼠關節炎指數明顯升高,大鼠滑膜組織中HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3蛋白表達明顯升高,Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達升高,Beclin1 mRNA和蛋白表達降低,表明模型制備成功。經過不同劑量松蘿提取物或HCQ的干預后,大鼠關節炎指數有所下降,IL-6炎性因子水平改善,滑膜組織Beclin1 mRNA和蛋白表達有不同程度升高,HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3蛋白表達降低,Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達降低。與HCQ組比較,松蘿提取物中、高劑量組的關節指數評分,血清IL-6、HMGB1水平,滑膜組織HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3、Beclin1蛋白表達及Beclin1、Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達無明顯變化(P>0.05)。透射電子顯微鏡顯示,松蘿提取物中、高劑量組及HCQ組自噬體數量增加,細胞凋亡程度加重,松蘿提取物可能通過調控細胞自噬達到抑制滑膜細胞炎癥反應的作用。藥物的劑量是影響治療效果的重要因素,本研究表明松蘿提取物低劑量組與模型組,松蘿提取物中、高劑量組與HCQ組上述指標未顯示明顯差異,為確保治療效果最大化,對該藥物的劑量需進行深入的研究,發現最佳劑量以便更好地評估藥物的療效和安全性。

綜上所述,松蘿提取物可能通過調控自噬水平降低炎癥反應。