miR-24-3p/S1PR2信號軸對大鼠RMECs損傷的作用與機制研究

賀蛟龍,徐云玲

(1.吉首大學第一附屬醫院/湘西土家族苗族自治州人民醫院重癥醫學科,湖南吉首 416000;2.浙江省立同德醫院/浙江省中醫藥研究院/浙江省中藥新藥研發重點實驗室,杭州 310007)

普遍研究認為,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起膿毒癥的發生機制與炎癥細胞因子“瀑布樣釋放”、血管氧化應激水平升高和內皮細胞中多糖-蛋白質復合物降解有關[1]。腎臟是膿毒癥的易損器官,嚴重膿毒癥患者中合并急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)發生率高達50%以上[2]。作為一類特殊微血管類型的細胞,腎小球內皮細胞(retinal microvascular endothelial cells,RMECs)損傷已被證實與AKI密切相關[3]。1-磷酸鞘氨醇受體2(sphingosine-1-phosphate receptors 2,S1PR2)在成年鼠腎臟和人血管細胞、血管內皮細胞中廣泛表達[4],不僅具有調節多種細胞增殖、生存及遷移等功能,還可以調節血管內皮細胞屏障的通透性[5-6],參與血管炎癥反應[7-8],介導血管平滑肌細胞的遷移和增殖[9],被認為在LPS血癥期間血管內皮的通透性和炎癥反應中起關鍵作用。隨著分子微生物學研究的不斷進展,越來越多的研究發現,微RNA(microRNA,miRNA)是參與腎臟各個結構與功能維持的重要穩態調節因子,可通過不完全互補結合到目的基因mRNA 3′ UTR,抑制蛋白翻譯進而抑制蛋白合成,從而調節多種生物學過程[10-11]。miRNA在AKI中多出現異常表達,可能參與AKI的發病機制,調節視網膜微血管內皮細胞凋亡、炎癥等過程[12]。在眾多miRNA中,miR-24-3p是研究較為廣泛的一組[13-14]。miR-24-3p在腫瘤組織中高度表達,并促進細胞增殖、遷移和癌細胞的侵襲,在缺血/再灌注中發揮心臟保護作用。基于以上研究背景和預測,本研究擬驗證在LPS誘導的RMECs中,miR-24-3p靶向調控S1PR2表達繼而影響細胞損傷和凋亡過程,以期為AKI的臨床治療提供新的思路和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與RMECs的分離培養鑒定

SPF級3～8 d齡SD大鼠6只購于北京阜華康生物科技股份有限公司[許可證號SYXK(贛)2020-0001]。動物適應環境:溫度(23±2)℃,濕度50%～75%,普通飼料喂養。參照GREEN等[15]的三步梯度篩網法分離腎小球。無菌條件下摘取4～6周大鼠腎臟,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后取腎皮質,剪碎后于70 μm細胞篩網研磨、過濾、離心得到腎小球。再取0.125%胰蛋白酶消化后的腎小球離心,棄上清液后加入配置好的內皮細胞培養基(20%胎牛血清,DMEM/F12,20 mg/L內皮生長因子),于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,3 d后第1次換液,隨后隔日換液。待細胞融合成單層時進行傳代,經鑒定后取第4～10代細胞用于后續實驗。

采用倒置顯微鏡觀察分離培養的細胞。0.125%胰酶消化細胞后,按4×104/cm2將細胞接種于24孔板中,待細胞鋪滿單層后用PBS清洗,4%多聚甲醛固定,PBS再次清洗,加5%牛血清白蛋白(BSA),37 ℃封閉30 min,分別加入一抗vWF(1∶200)孵育4 h、二抗Cy3標記的(1∶200)孵育30 min,PBS洗3次加DAPI避光孵育5 min,50%甘油封閉,熒光顯微鏡觀察。

1.1.2儀器與試劑

倒置熒光顯微鏡(CKX53)購于奧林巴斯(上海)有限公司;全自動酶標儀(WD-2102B)、電泳儀(DYY-8C)和蛋白垂直電泳儀(DYY-6C)均購于北京六一儀器廠;超高靈敏度化學發光成像系統(Chemi DocTMXRS+)、熒光PCR儀(CFX ConnectTM實時)均購于伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;化學發光圖像分析系統(Tanon-5200,上海天能科技有限公司);多功能酶標儀(SuPerMax 3100)購于上海閃譜生物科技有限公司。胎牛血清(FBS,10099-141)、營養混合液F-12(DMEM/F-12)、OPTI-MEM培養基(31985-062)、GlutaMAXTM添加劑(10565018)、超敏發光液(RJ239676)購于美國Gibco公司;胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(T1300)、牛血清白蛋白(BSA,A8020)購于北京索萊寶科技有限公司;大鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α ELISA試劑盒(MM-0180R2)、大鼠白細胞介素(interleukin,IL)-1β ELISA試劑盒(MM-0047R2)購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;Trizon Reagent(CW0580S)、miRNA提取試劑盒(CW0627S)、超純RNA提取試劑盒(CW0581M)、BCA蛋白定量試劑盒(CW0014S)購于北京康為世紀生物科技有限公司;cDNA第一鏈合成試劑盒(MR101-02)、實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(MQ101-02)、逆轉錄(RT)-qPCR專用預混液(+gDNA wiper,R223-01)、通用型高敏感度染料法定量PCR檢測試劑盒(Q711-02)購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;小鼠抗β-actin單克隆抗體(TA-09,1∶2 000)、辣根化物酶標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG,H+L,ZB-2305,1∶2 000)、辣根化物酶標記的山羊抗兔IgG(H+L,ZB-2301,1∶2 000)購于北京中杉金橋生物技術有限公司;兔抗S1PR2抗體(21180-1-ap,1∶1 000)購于美國Proteintech公司;兔抗caspase-3(af6311,1∶500)、兔抗caspase-9(AC062,1∶500)、兔抗細胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20,CDC20,af4759,1∶1 000)、兔抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF,af5131,1∶1 000)、vWF(AF3000,1∶200)均購于美國Affinity公司;Cy3標記的山羊抗兔IgG (H+L,As007,ABclonal,1∶200)購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。miR-24-3p inhibitor、miR-24-3p inhibitor NC、LipofectamineTM2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細胞實驗分組

當細胞密度達70%時進行轉染;按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行轉染操作。實驗根據加入轉染物的不同分為4組:對照組(control組),LPS模型組(LPS組),inhibitor NC+LPS組(轉染miR-24-3pinhibitor NC試劑100 nmol/L),LPS+miR-24-3p inhibitor組(轉染miR-24-3p inhibitor試劑100 nmol/L)。各組各設6個復孔,加藥前24 h內換無血清培養液。

1.2.2總RNA提取及RT-qPCR檢測

收集各組細胞,按試劑盒說明書操作提取細胞中總RNA,按miRNA逆轉錄試劑盒說明書操作逆轉錄合成cDNA,測定合成的cDNA水平和純度,采用RT-qPCR檢測miR-24-3p的mRNA水平。引物如下:miR-24-3p上游引物5′-GCGTGGCTCAGTTCAGCAG-3′,下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;按照PCR試劑盒說明書要求建立反應體系,PCR循環條件如下:95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,40個循環;72 ℃ 30 s。以U6和β-actin作為內參,基因的相對表達水平用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.3CCK8檢測與細胞活力計算

細胞生長至70%～80%融合時采用胰酶消化、重懸,細胞計數,調整細胞密度為1×104/孔;24 h后進行CCK8檢測,在96孔板中配置100 μL的細胞懸液,每孔加入10 μL CCK8試劑,置于恒溫培養箱中避光孵育2 h;在酶標儀450 nm波長處檢測各孔的吸光度(A)值。細胞活力V細胞計算公式為:

V細胞=(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)×100%

(1)

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平

轉染miR-24-3p inhibitor成功后的RMECs細胞加入LPS(1 μg/mL)誘導處理24 h。收集并洗滌細胞3次,胰酶消化細胞、離心,按試劑盒方法加入染料,采用流式細胞儀檢測。另取轉染miR-24-3p inhibitor成功后的RMECs細胞加入LPS(1 μg/mL)誘導處理24 h。完成造模后,采用無血清培養基按照1∶1 000稀釋2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),終濃度為10 μmol/L;棄去細胞培養液,向細胞中加入稀釋好的DCFH-DA,37 ℃培養箱孵育20 min;采用無血清培養液洗滌3次,充分去除多余的、未進入細胞的DCFH-DA;加1 mL PBS洗滌,1 500 r/min離心5 min,棄上清液;加500 μL PBS重懸細胞后采用流式細胞儀檢測。

1.2.5細胞上清液TNF-α、IL-1β表達及SOD、MDA水平檢測

轉染miR-24-3p inhibitor成功后的RMECs細胞加入LPS(1 μg/mL)誘導處理24 h。完成造模后,收集上清液;上清液離心,分裝,-80 ℃凍存。根據ELISA法測定培養液中TNF-α、IL-β。另取轉染miR-24-3p inhibitor成功后的RMECs細胞加入LPS(1 μg/mL)誘導處理24 h。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD,硫代巴比妥酸比色分析法測定MDA,操作步驟按試劑盒說明書。SOD活力VSOD計算公式為:

VSOD=K/50%×i×(0.24 mL/0.02 mL)/S

(2)

其中,K代表SOD抑制率,i代表反應體系稀釋倍數,S代表待測樣本蛋白水平。

1.2.6qPCR檢測

收集細胞,采用miRNA提取試劑盒提取總miRNA,測定其水平和純度,通過HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR逆轉錄試劑盒合成產物,利用PCR儀進行qPCR檢測。引物如下:S1PR2上游引物5′-CGCCAAGGTCAAGCTCTA-3′,下游引物5′-GCAAGCCTCCAGATGGT-3′;GAPDH上游引物5′-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′,下游引物5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG -3′。 反應體系如下:2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,cDNA 1 μL,上下游引物各0.4 μL,RNase Free dd H2O補足體積到20 μL。反應過程:95 ℃、10 min;95 ℃、10 s,57 ℃、30 s,40個循環;72 ℃、30 s。

1.2.7蛋白免疫印跡(Western blot)檢測

收集轉染后的RMECs細胞,提取細胞總蛋白,BCA法檢測蛋白水平后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉聚偏二氟乙烯膜孵育一抗,4 ℃過夜,洗膜3次后室溫下孵育辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠或兔IgG二抗2 h,洗膜后采用增強化學發光液顯影拍照,Image J軟件對蛋白條帶進行半定量分析,半定量結果以目標條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 RMECs鑒定結果

RMECs原代分離培養3～4 d后,在倒置顯微鏡下可觀察到貼壁生長的散在集落,細胞以梭形和多角形為主,6 d后逐漸整合成單層。免疫熒光檢測可見RMECs呈多角形,細胞質Ⅷ因子相關抗原表達呈強陽性,說明分離培養的細胞為RMECs,見圖1。

圖1 RMECs的免疫熒光檢測結果

2.2 4組RMECs增殖與凋亡情況比較

與control組比較,LPS組的凋亡率上升(P<0.05);與inhibitor NC+LPS組比較,miR-24-3p inhibitor+LPS組凋亡率上升(P<0.05),見圖2。

①:control組;②:LPS組;③:inhibitor NC+LPS組;④:LPS+miR-24-3p inhibitor組;a：P<0.05,與control組比較;b：P<0.05,與inhibitor NC+LPS組比較。

2.3 4組RMECs細胞炎癥細胞因子表達水平比較

與control組比較,LPS組的TNF-α、IL-1β水平上升(P<0.05);與inhibitor NC+LPS組比較,miR-24-3p inhibitor+LPS組的TNF-α、IL-1β水平上升(P<0.05),見圖3。

A:4組TNF-α水平比較;B:4組IL-1β水平比較;①:control組;②:LPS組;③:inhibitor NC+LPS組;④:LPS+miR-24-3p inhibitor組;a：P<0.05,與control組比較;b：P<0.05,與inhibitor NC+LPS組比較。

2.4 4組RMECs內ROS水平比較

與control組比較,其他3組的ROS表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4。

①:control組;②:LPS組;③:inhibitor NC+LPS組;④:LPS+miR-24-3p inhibitor組;a：P<0.05,與control組比較。

2.5 4組RMECs氧化應激損傷相關因子表達水平比較

與control組比較,LPS組的MDA、SOD表達水平上升(P<0.05);與inhibitor NC+LPS組比較,miR-24-3p inhibitor+LPS組的MDA表達水平上升(P<0.05),SOD表達水平下降(P<0.05),見圖5。

A:4組MDA水平比較;B:4組SOD水平比較;①:control組;②:LPS組;③:inhibitor NC+LPS組;④:LPS+miR-24-3p inhibitor組;a：P<0.05,與control組比較;b：P<0.05,與inhibitor NC+LPS組比較。

2.6 4組RMECs S1PR2表達水平比較

與control組比較,LPS組的S1PR2表達上升(P<0.05);與inhibitor NC+LPS組比較,miR-24-3p inhibitor+LPS組的S1PR2表達下降(P<0.05),見圖6。

①:control組;②:LPS組;③:inhibitor NC+LPS組;④:LPS+miR-24-3p inhibitor組;a：P<0.05,與control組比較;b：P<0.05,與inhibitor NC+LPS組比較。

2.7 4組RMECs相關蛋白表達水平比較

與control組比較,LPS組的S1PR2、caspase-3、caspase-9蛋白表達水平上升,CDC20、VEGF蛋白表達水平下降,差異有統計學意義(P<0.05);與inhibitor NC+LPS組比較,miR-24-3p inhibitor+LPS組的S1PR2、caspase-9、caspase-3蛋白表達水平下降,CDC20、VEGF蛋白表達水平上升,差異有統計學意義(P<0.05),見圖7。

3 討 論

AKI是臨床上常見的危重癥。研究表明,腎臟微血管內皮細胞損傷與大部分腎臟疾病密切相關,是加重腎臟病進展的重要因素[16]。近年來,臨床雖然對腎臟微血管內皮細胞損傷的具體因素及相關機制尚不清楚,而探尋上下游基因水平、調控機制對于治療甚至干預AKI都有重要臨床價值。

miRNA可以調節靶基因的表達,目前已有動物實驗結果顯示,某些miRNA可作為AKI早期診斷的標志物[17-18]。本研究結果表明miR-24-3p inhibitor通過聯動抑制S1PR2的表達,進而下調caspase-3、caspase-9的表達水平,激活CDC20、VEGF的表達,降低細胞炎癥細胞因子TNF-α與促進胞氧化應激損傷因子MDA的水平,保護細胞,減少LPS對細胞造成損傷。

膿毒癥中大量LPS存在于循環血液,其可直接損傷內皮細胞或通過間接方式引起內皮細胞的激活和損傷[19]。有研究表明,LPS可以呈劑量依賴性引起RMECs的形態損傷,濃度為10 mg/L時即可使損傷標志物LPS明顯增加[20],同時上調組織因子的合成及其在細胞表面的表達水平,促進凝血系統啟動。本研究中,LPS所致的內皮細胞損傷在鏡下表現為細胞器發生明顯空泡性變性。

miR-24-3p inhibitor緩解LPS誘導RMECs凋亡的作用機制還有待于進一步研究,后續實驗可圍繞臨床藥物通過miR-24-3p介導靶向調控S1PR2分子軸來開展更深入的探索。