超重結腸癌患者腸道菌群特征及其與血清生化指標的相關性

陳雪薇,雷 倩,李一榮

(武漢大學中南醫院檢驗科,武漢 430071)

最新數據顯示我國超重人口的比例已高達28.1%[1]。臨床研究表明,超重與結腸癌患者遠端轉移和不良預后呈正相關[2-3]。人體腸道中存在大量的微生物群與機體的相互作用可直接或間接地影響身體健康和疾病進展[4]。文獻報道高脂飲食可通過腸道菌群及其代謝產物促進結腸癌發生、發展[5-6]。腫瘤患者常常存在全身性的代謝紊亂,使機體長期處于一種中低強度的應激狀態,導致預后不良[7]。因此,本研究采用 16S rDNA 測序技術研究超重與BMI正常結腸癌患者腸道菌群的差異性,并分析核心菌屬與血清生化指標的相關性,為進一步研究超重調節結腸癌惡性進展的機制提供依據,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年6—12月于本院治療的88例結腸癌患者為研究對象,其中男50 例,女38例,年齡(57.68±9.38) 歲。納入標準:(1)確診為結腸癌;(2)BMI為18.5～28.0 kg/m2;(3)無家族性腺瘤性息肉、遺傳性結腸癌或炎癥性腸病的患者;(4)未經過手術、放化療、免疫治療等抗腫瘤治療;(5)在收集標本之前3個月內未應用過抗生素或益生菌。根據BMI將研究對象分為正常組(BMI 18.5～<24.0 kg/m2,n=55)和超重組(BMI 24.0～28.0 kg/m2,n=33),兩組一般資料比較,差異無統計學意義(P<0.05),具有可比性,見表1。本研究獲得醫院倫理學委員會批準(審批號:臨研倫[2021041])。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1糞便標本的采集和保存

采集所有研究對象新鮮自然排出的糞便約2 g,裝入2 mL試管中,保存于液氮中。標本通過干冰寄送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行測序分析。

1.2.216S rDNA測序與分析

采用試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)提取糞便DNA。取質量合格的DNA(30 ng/μL)對16S rDNA目標區域進行擴增,使用AMPure XP Beads(美國貝克曼庫爾特公司)對PCR擴增產物進行純化。定量后,根據 Novaseq6000的PE250模式pooling上機測序。通過α和β多樣性分析反映兩組微生物群落的多樣性。基于樣品菌群的相對豐度對標本做主坐標分析(principal co-ordinate analysis,PCoA)。通過PICRUSt軟件對腸道菌群功能進行預測,組間差異比較采用STAMP軟件實現。

1.2.3血清生化指標的檢測

血紅蛋白、白蛋白、球蛋白、血糖、尿酸、尿素氮和肌酐等血清生化指標由貝克曼血液分析儀或雅培全自動生化分析儀檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組糞便腸道菌群多樣性分析

α多樣性分析結果顯示,兩組香農指數、辛普森指數和菌種多樣性指數比較,差異無統計學意義(P>0.05)。PCoA分析結果顯示,兩組標本均未能各自聚集成簇,采用Weighted-unifrac計算β多樣性,差異無統計學意義(P>0.05),見圖1。

A:α多樣性分析;B:PCoA分析。

2.2 兩組糞便腸道菌群結構分析

選用相似水平為99%的分類單元(operational taxonomic unit,OTU)標本表進行聚類,繪制Venn圖。兩組88個標本共產生964個OTU,其中兩組共有的OTU為572個,超重組特有的OTU為201個,正常組特有的OTU為191個。

在門水平上,兩組糞便中的優勢菌門主要是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)組成,占總群落的98%以上。在屬水平上,超重組糞便中Tyzzerella_4、Lachnospiraceae_UCG-010、Sediminibacterium、Candidatus_Stoquefichus、Morganella、Delftia、Cutibacterium、Ochrobactrum及Johnsonella的平均相對豐度明顯高于正常組,而Lachnoclostridium、CAG-873、Dysgonomonas、Pyramidobacter、Facklamia、Methanosphaera及GCA-900066575的平均相對豐度明顯低于正常組,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 兩組糞便關鍵物種分析

菌群進化樹狀圖結果顯示超重組腸道富集的菌群分布較廣泛,線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)結果顯示兩組菌群富集不同,見圖2。

2.4 兩組腸道菌群功能預測分析

兩組Level3類別上存在9種差異表達的功能,超重組Ⅱ型酮化合物的生物合成、甘油脂代謝、磷酸戊糖途徑、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、非同源性末端接合和糖酵解/糖異生較正常組減弱,而甾體激素生物合成、α亞麻酸代謝和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)受體相互作用較對照組增強,見圖3。

圖3 兩組腸道菌群功能預測分析

2.5 糞便關鍵菌屬與血清生化指標之間的相關性分析

Spearman分析結果顯示,Tyzzerella_4與BMI呈正相關(r=0.286,P=0.007),Dysgonomonas與白蛋白球蛋白比值呈正相關(r=0.237,P=0.027),Pyramidobacter與尿酸水平呈負相關(r=—0.292,P=0.006),見圖4。

a：P<0.05,明顯相關。

3 討 論

結腸癌是發病率最高的消化道腫瘤,超重是結腸癌發病的風險因素[8-9]。近年來超重人群在我國的迅速增加,因此超重在結腸癌發生、發展中的作用及其機制成為亟須破解的醫學問題。文獻報道,肥胖或高脂飲食誘導的腸道菌群紊亂均可加劇結腸癌惡性進展[10]。因此本研究通過對BMI正常和超重結腸癌患者的糞便菌群結構進行比較,分析腸道核心菌屬及其與血清生化指標的相關性,有望為研究超重在結腸癌進展中的作用及其機制提供依據。

本研究通過16S rDNA測序分析發現,BMI正常和超重結腸癌患者腸道菌群多樣性無明顯差異。比較兩組結腸癌患者腸道菌群結構,在屬水平上,超重組糞便中Tyzzerella_4、Lachnospiraceae_UCG-010、Sediminibacterium、Morganella和Delftia等平均相對豐度明顯高于正常組,而Lachnoclostridium、CAG-873、Dysgonomonas、Pyramidobacter及Facklamia等平均相對豐度明顯低于正常組。LEfSe分析腸道關鍵菌群結果表明,Tyzzerella_4、Lachnoclostridium、CAG-873、Pyramidobacter、Dysgonomonas和Facklamia可能為結腸癌患者腸道關鍵菌屬。ZHANG等[11]也發現Tyzzerella_4相對豐度在晚期結腸癌患者糞便中明顯升高,并可聯合糞便免疫化學實驗輔助結腸癌診斷。降低腸道中條件致病菌Morganella的豐度能改善局部免疫微環境,保護腸道屏障功能[12]。Dysgonomonas被認為是一種潛在的益生菌,能調節腸道炎癥[13]。雖然通過比較發現某一菌群在超重患者腸道中富集或缺失并不能斷定其與結腸癌的發生、發展存在因果關系,但找到超重結腸癌患者腸道微生態中的核心菌群可能為研究肥胖促結腸癌進展的機制提供重要依據。

為了進一步探究超重對結腸癌患者腸道菌群功能的影響,本研究利用PICRUSt對腸道菌群功能預測后發現,超重組腸道菌群的Ⅱ型酮化合物的生物合成、甘油脂代謝、磷酸戊糖途徑、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、非同源性末端接合和糖酵解/糖異生減弱,而甾體激素生物合成、α亞麻酸代謝和ECM受體相互作用增強。既往研究中發現肥胖小鼠腸道菌群的甘油脂代謝明顯降低,表明腸道脂肪酸降解水平降低[14]。磷酸戊糖途徑的主要產物是還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和磷酸戊糖。NADPH提供各種代謝反應中的供氫體,防止各種蛋白質和酶的氧化[15]。磷酸戊糖是核酸生物合成所必需的,加速磷酸戊糖途徑可提高DNA損傷修復的能力[16]。因此,超重組腸道菌群磷酸戊糖途徑的減少可能表明腸道抗氧化和DNA損傷修復能力降低。腸道菌群可通過刺激不同的酶來代謝甾體激素[17-18]。研究發現,血清甾體激素水平與結腸癌患者結腸腺瘤樣息肉(adenomatous polyposis coli,APC)基因突變相關[19]。

本研究進一步分析了腸道核心菌屬相對豐度與血清生化指標的相關性,發現超重結腸癌患者腸道核心菌屬(Tyzzerella_4、Dysgonomonas和Pyramidobacter)與BMI、白蛋白球蛋白比值及尿酸明顯相關。BMI是判斷人群肥胖程度的重要指標,臨床研究發現BMI增加與結腸癌的發病率升高密切相關[20-21]。Tyzzerella_4是一種與不良飲食和肥胖相關的條件致病菌[22]。Tyzzerella_4可通過降低抗腫瘤的細菌代謝產物丁酸分泌,促進腫瘤細胞增殖,從而加速腫瘤惡性進展[23]。白蛋白球蛋白比值通常代表肝臟或腎臟對白蛋白的合成及代謝情況與免疫器官產生的球蛋白之間的平衡[24]。超重的結腸癌患者常伴有內臟肥胖,機體處于一種慢性炎癥狀態,免疫器官生成大量免疫球蛋白,調節機體免疫環境。Dysgonomonas可維持腸道菌群的動態平衡減輕病原體導致的腸道炎癥[25]。尿酸是嘌呤代謝的終產物,主要通過腎臟排泄。臨床研究發現,血尿酸水平升高與結腸癌轉移及不良預后呈正相關[26]。慢性腎病患者血尿酸升高時,腸道中Pyramidobacter相對豐度明顯降低[27]。但這些核心腸道菌屬影響結腸癌進展的機制尚不明確,需要進一步的研究及驗證。

綜上所述,與正常BMI的結腸癌患者比較,超重結腸癌患者腸道菌群中益生菌豐度進一步減少,調節免疫環境和炎癥反應的致病菌豐度增加,且腸道核心菌屬與血清生化指標白蛋白球蛋白比值和尿酸明顯相關。但糞便微生物群易受生活習慣和飲食結構影響,本研究選擇的均是同一醫院就診的結腸癌患者,患者日常生活和飲食習慣不同存在一定影響,未來仍需通過前瞻性、多中心研究及更加細化的分組比較來驗證本研究結論。