內質網應激上調導致機械通氣相關性膈肌功能障礙研究

張菊梅,吳松林,關發升,涂 銳,李學欣,劉 力

(西南醫科大學附屬醫院麻醉科,四川瀘州 646000)

機械通氣(mechanical ventilation,MV)是一種挽救生命的干預措施,全球每年有超過1 500萬患者在外科手術和危重疾病中使用機械通氣來提供充足的肺通氣[1-2]。然而,機械通氣是一把“雙刃劍”,長期的機械通氣會導致膈肌纖維萎縮和收縮力下降,從而引起明顯的膈肌功能障礙,稱為機械通氣相關性膈肌功能障礙(ventilation-induced diaphragmatic dysfunction,VIDD)。VIDD不僅對患者生存率和預后有明顯的不良影響,也是臨床上導致脫機困難的主要原因,會產生較大的醫療負擔。超過50%的機械通氣患者在氣管插管24 h之內迅速出現VIDD,其發生率與通氣時間延長、撤機困難、再插管率存在明顯相關性[3-5]。目前,臨床尚缺乏預防和治療VIDD的相應措施,因此對VIDD機制的詳細了解對臨床防治膈肌功能障礙顯得尤其重要。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是指細胞受到內外因素(氧化應激、鈣離子紊亂、缺氧、感染、營養物質缺乏等)的刺激時,內質網形態、功能的平衡狀態受到破壞后發生分子生化的改變,蛋白質加工運輸受阻,內質網內累積大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質[6-7]。研究報道ERS在很多肌肉疾病中存在,其中ERS在膿毒癥相關膈肌功能障礙中發揮了重要作用,膿毒癥相關膈肌功能障礙和VIDD之間有許多共同致病機制,包括氧化應激、蛋白水解系統激活、線粒體功能障礙、細胞因子的大量激活等[8-11]。但ERS在VIDD是否上調,以及隨通氣時間延長膈肌功能障礙和ERS之間的關系尚缺乏報道。因此,本研究建立了大鼠不同通氣時長的VIDD模型,探索ERS是否在大鼠VIDD中上調,以及隨著通氣時間延長ERS和膈肌功能障礙的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇9～11周齡無特殊病原體(SPF)級雄性SD大鼠30只,平均體重(270±30)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,動物生產許可證號:SCXK(京)2019-0008。大鼠飼養于無菌層流鼠籠內,溫度(25±2)℃,相對濕度(50±5)%,白晝交替,大鼠可以自由進食水。動物實驗遵循《實驗動物管理與使用指南》,動物實驗經西南醫科大學動物實驗中心倫理委員會批準[許可證號:SYXK(川)2018-065]。將30只大鼠按隨機數字表法分為5組,分別為自主呼吸對照組(Con組)、機械通氣6 h組(MV6 h組)、機械通氣12 h組(MV12 h組)、機械通氣18 h組(MV18 h組)、機械通氣24 h組(MV24 h組),每組6只。

1.2 方法

1.2.1大鼠機械通氣模型的建立

按照SMUDER等[12]的方法建立大鼠機械通氣模型。具體步驟如下:腹腔注射60 mg/kg 的戊巴比妥鈉進行基礎麻醉。麻醉成功后,將大鼠置于溫控加熱毯上并固定。然后準備頸部皮膚(備皮、消毒),無菌操作解剖游離氣管;行氣管切開插管,接容量控制模式的小動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。潮氣量(VT)設定為8 mL/kg體重,呼氣末正壓(PEEP)設定為0 cmH2O,呼吸頻率(RR)設定為70～75次/min。尾靜脈行24GY型留置針(肝素預充)置管,以2 mL·kg-1·h-1的生理鹽水和10 mg·kg-1·h-1的戊巴比妥鈉持續泵入。在實驗期間,通過使用加熱毯將體溫維持在 37 ℃;實驗過程中,定時進行護理:翻身、按摩膀胱、吸痰等。

1.2.2功能學檢測指標及方法

(1)復合肌肉動作電位(CMAP)檢測:使用RM6240生物信息采集系統記錄膈肌CMAP。將第一針作為接地電極插入大鼠尾巴近端皮下,下一針刺入對側腹部作為參考電極,電極片貼于同側肋骨下緣作為記錄電極,最后兩根針作為刺激電極,垂直插入鎖骨同側上方,距氣管0.5 cm處。電極插入深度為1.0 cm,兩針之間的距離為0.5 cm。所述近心端連接有紅色刺激連接器,所述遠心端連接有黑色刺激連接器,刺激方式采用單刺激,且為正電壓刺激。刺激強度為12 V,波寬為1 ms,延遲為1 ms。刺激之間有30 s的間隔,連續重復3次刺激以獲得平均響應。(2)疲勞指數:使用脈沖方波(強度15 V,波寬0.5 ms,延時20 ms)對肌肉進行50 Hz連續刺激2 min,以刺激2 min后的力比開始刺激的力,用該比值描述膈肌的疲勞指數。(3)頻率-收縮曲線測量:將約3 mm寬、1 cm長的肋膈肌條置于Krebs-Hensleit溶液中,用95% O2、5% CO2氣體平衡,并保持在37 ℃和pH 7.4。大鼠四肢肌肉用彈簧夾夾緊,并連接到電磁力傳感器上,使用最大刺激電壓(15 V)確定最佳收縮長度(Lo)。然后,以10、20、30、50、60、80、100、120 Hz連續刺激肌肉600 ms,每個刺激訓練間隔1 min以確定頻率收縮曲線關系,收縮力以生理橫截面積歸一化計算。

1.2.3膈肌組織病理學觀察及膈肌纖維橫截面積測定

膈肌組織用4%多聚甲醛固定24 h,經全自動脫水機梯度乙醇脫水,包埋、切片后進行染色。染色主要步驟:先將切片脫蠟至水,蘇木素染色后使用鹽酸乙醇分化,溫水反藍后置于85%的乙醇中5 min,用伊紅染色,再次經梯度乙醇脫水后透明封固。光鏡下觀察膈肌組織的病理學改變,采用圖像分析軟件Motic Images Advanced測定膈肌纖維橫截面積。

1.2.4膈肌組織中ERS標志物和膈肌萎縮指標基因檢測

采用實時熒光定量逆轉錄PCR(RT-qPCR)檢測膈肌組織中ERS標志物[C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、葡萄糖調節蛋白94(GRP94)]和膈肌萎縮指標[肌肉特異性環指蛋白-1(MuRF-1)、肌肉萎縮F盒蛋白(Atrogin-1)]mRNA的表達。取適量大鼠膈肌組織,提取組織總RNA,逆轉錄成cDNA。按照試劑盒說明書進行實驗,配制PCR反應液,總體系為25 μL,PCR反應條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環。引物序列見表1。

表1 膈肌萎縮指標及ERS標志物基因引物序列(5′-3′)

1.2.5膈肌組織中ERS標志物和膈肌萎縮指標蛋白檢測

采用Western blot檢測ERS標志物(CHOP、GRP78和GRP94)和膈肌萎縮指標(MuRF-1和Atrogin-1)水平。取大鼠膈肌組織,常規提取蛋白,測定蛋白質含量、調整蛋白質濃度后,上樣、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、封閉,加入稀釋后的CHOP(1∶1 000)、GRP78(1∶1 000)、GRP94(1∶1 000)、MuRF-1(1∶1 000)、Atrogin-1(1∶1 000)一抗 4 ℃過夜。TBST洗滌,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000),室溫孵育60 min。滴加電化學發光(ECL)試劑,于暗室中曝光、顯影。使用Image J軟件分析,以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參,以目的條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 膈肌功能學指標

2.1.1各組大鼠的CMAP比較

各組CMAP幅值分別為Con組(11.43±1.81)mV、MV6 h組(8.45±0.86)mV、MV12 h組(6.92±0.49)mV、MV18 h組(4.24±0.70)mV、MV24 h組(2.41±0.77)mV;各機械通氣組與Con組相比,差異均有統計學意義(P<0.05),且隨著通氣時間延長,CMAP幅值逐漸減小,見圖1A。各組CMAP時程分別為Con組(3.27±0.60)ms、MV6 h組(3.56±0.56)ms、MV12 h組(4.68±0.48)ms、MV18 h組(5.12±0.72)ms、MV24 h組(6.35±0.83)ms;MV12 h組、MV18 h組、MV24 h組與Con組相比,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖1B。CMAP的代表圖,見圖1C。

A:各組大鼠CMAP幅值比較柱狀圖;B:各組大鼠CMAP時程比較柱狀圖;C:CMAP的代表圖;①:Con組;②:MV6 h組;③:MV12 h組;④:MV18 h組;⑤:MV24 h組;a：P<0.05,與Con組比較;b：P<0.05,與MV6 h組比較;c：P<0.05,與MV12 h組比較。

2.1.2大鼠膈肌的疲勞指數比較

各組的疲勞指數分別為Con組(38.68±1.53)%、MV6 h組(32.23±1.36)%、MV12 h組(25.84±1.25)%、MV18 h組(22.31±1.21)%、MV24 h組(20.47±0.88)%;各機械通氣組與Con組相比,差異均有統計學意義(P<0.05),且隨著通氣時間的延長膈肌疲勞指數越來越小,見圖2A。疲勞指數的代表圖,見圖2B。

A:各組大鼠疲勞指數比較柱狀圖;B:疲勞指數的代表圖;①:Con組;②:MV6 h組;③:MV12 h組;④:MV18 h組;⑤:MV24 h組;a：P<0.05,與Con組比較;b：P<0.05,與MV6 h組比較;c：P<0.05,與MV12 h組比較。

2.1.3大鼠膈肌頻率-收縮曲線比較

總體上隨著刺激頻率增加,各組大鼠單位平方厘米的膈肌收縮力增加。在同一刺激頻率下,與Con組相比,MV18 h組和MV24 h組的收縮力明顯減小(P<0.05),見圖3。

a：P<0.05,與Con組比較。

2.2 膈肌HE染色

光鏡下可見,Con組大鼠膈肌組織肌束結構清晰、邊界分明,肌纖維排列較為緊密,細胞核呈扁圓形或橢圓形,位于細胞周緣,細胞質染色較為均勻,未見明顯肌纖維萎縮;機械通氣組,隨著通氣時間的延長,肌束結構不清晰,細胞間隔略有增寬,肌纖維小簇性萎縮,萎縮程度輕重不一,MV24 h組萎縮最為嚴重,見圖4。各組的膈肌纖維橫截面積分別為Con組(6 161.34±345.32)μm2、MV6 h組(4 684.45±329.10)μm2、MV12 h組(3 404.56±412.28)μm2、MV18 h組(2 492.54±245.72)μm2、MV24 h組(2 147.00±189.12)μm2,與Con組相比,各機械通氣組膈肌纖維橫截面積均明顯降低(P<0.05),且隨著通氣時間延長,膈肌萎縮加重,橫截面積減小,見圖5。

①:Con組;②:MV6 h組;③:MV12 h組;④:MV18 h組;⑤:MV24 h組;a：P<0.05,與Con組比較;b：P<0.05,與MV6 h組比較;c：P<0.05,與MV12 h組比較。

2.3 膈肌萎縮蛋白MuRF-1、Atrogin-1 mRNA及蛋白表達水平

與Con組相比,MV12 h組、MV18 h組、MV24 h組大鼠膈肌MuRF-1 mRNA相對表達水平均明顯升高(P<0.05),且隨著通氣時間延長,MuRF-1 mRNA相對表達水平逐漸升高,見圖6A。與Con組相比,各機械通氣組大鼠膈肌Atrogin-1 mRNA相對表達水平均明顯升高(P<0.05),且MV24 h組最高,見圖6B。與Con組相比,各機械通氣組大鼠膈肌MuRF-1、Atrogin-1相對表達水平均明顯升高(P<0.05),且隨著機械通氣時間延長,MuRF-1、Atrogin-1相對表達水平逐漸升高,見圖6C～E。

A:各組大鼠膈肌MuRF-1 mRNA相對表達水平比較柱狀圖;B:各組大鼠膈肌Atrogin-1 mRNA相對表達水平比較柱狀圖;C:各組大鼠膈肌MuRF-1相對表達水平比較柱狀圖;D:各組大鼠膈肌Atrogin-1相對表達水平比較柱狀圖;E各組大鼠膈肌MuRF-1和Atrogin-1電泳圖;①:Con組;②:MV6 h組;③:MV12 h組;④:MV18 h組;⑤:MV24 h組;a：P<0.05,與Con組比較;b：P<0.05,與MV6 h組比較;c：P<0.05,與MV12 h組比較;d：P<0.05,與MV18 h組比較。

2.4 膈肌ERS標志物CHOP、GRP78、GRP94 mRNA及蛋白表達水平

與Con組相比,各機械通氣組大鼠膈肌CHOP、GRP78、GRP94 mRNA相對表達水平均明顯升高(P<0.05),且總體隨著通氣時間延長,各ERS標志物mRNA相對表達水平逐漸升高,見圖7A～C。與Con組相比,MV12 h組、MV18 h組、MV24 h組大鼠膈肌CHOP、GRP78、GRP94相對表達水平均明顯升高(P<0.05),且隨著通氣時間延長,各ERS標志物相對表達水平升高,MV24 h組最高,見圖7D～G。

A:各組大鼠膈肌CHOP mRNA相對表達水平比較柱狀圖;B:各組大鼠膈肌GRP78 mRNA相對表達水平比較柱狀圖;C:各組大鼠膈肌GRP94 mRNA相對表達水平比較柱狀圖;D:各組大鼠膈肌CHOP、GRP78、GRP94電泳圖;E:各組大鼠膈肌CHOP相對表達水平比較柱狀圖;F:各組大鼠膈肌GRP78相對表達水平比較柱狀圖;G:各組大鼠膈肌GRP94相對表達水平比較柱狀圖;①:Con組;②:MV6 h組;③:MV12 h組;④:MV18 h組;⑤:MV24 h組;a：P<0.05,與Con組比較;b：P<0.05,與MV6 h組比較;c：P<0.05,與MV12 h組比較;d：P<0.05,與MV18 h組比較。

3 討 論

膈肌作為人體最主要的呼吸肌,正常呼吸過程中有75%～80%的呼吸功是靠膈肌完成,長時間的機械通氣,膈肌處于廢用狀態,會導致膈肌萎縮和收縮力下降,稱為VIDD[13-14]。當細胞存在缺氧、氧化應激、感染等情況,內質網形態、功能受到破壞,導致蛋白質加工運輸受阻,表現為未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網上累積,從而激活ERS感受器,觸發下游凋亡通路[15-16]。本研究表明在機械通氣的膈肌中會激活ERS,且隨著通氣時間延長,ERS程度加重,膈肌功能障礙加重。

在本研究中,與Con組相比,機械通氣組隨著通氣時間延長,膈肌肌力逐漸減低,膈肌的抗疲勞性下降,CMAP的幅值減小,時程延長。膈肌功能障礙的程度隨著機械通氣時間的延長而逐漸加重,與臨床上的機械通氣患者類似,越長時間使用呼吸機的患者越難撤機,自主呼吸功能恢復也越緩慢[17]。隨著通氣時間延長,大鼠膈肌肌束結構不清晰,細胞間隔略有增寬,肌纖維小簇性萎縮,萎縮程度輕重不一,在MV24 h組膈肌萎縮最為嚴重,膈肌纖維橫截面積最小;膈肌萎縮蛋白MuRF-1和Atrogin-1的表達也隨著機械通氣時間的延長逐漸升高。在機械通氣的膈肌中,蛋白質分解加速,合成減少,隨著通氣時間延長,萎縮也越明顯,包括膈肌纖維橫截面積的減小和萎縮蛋白MuRF-1和Atrogin-1表達的增多。

ERS標志物CHOP、GRP78、GRP94在機械通氣大鼠膈肌中的表達也隨通氣時間延長而升高。越來越多的證據表明,ERS在肌肉功能障礙的發病機制中起作用,內質網作為細胞中蛋白質的加工廠和鈣離子的儲存器,在肌肉收縮活動中有必不可少的作用[18-19]。在VIDD中,氧化應激、鈣離子紊亂、線粒體功能障礙等均可激活ERS,從而引起ERS相關蛋白表達增加。內質網上有3個跨膜傳感器:蛋白激酶r樣內質網激酶(PERK)、肌醇-需要蛋白1(IRE1)和激活轉錄因子6(ATF6),生理情況下與GRP78結合處于失活狀態,當發生ERS時,GRP78與傳感器解離,傳感器被激活,啟動未折疊蛋白反應,緩解內質網的壓力[20-21]。未折疊蛋白的積累過程中,內質網伴侶蛋白,包括GRP78和GRP94上調,GRP78和GRP94結合到錯誤折疊的多肽鏈上,以防止形成聚集物,并協助其正確折疊[22-23]。在發生ERS,內質網功能嚴重受損時,細胞會通過上調CHOP引發凋亡信號,CHOP在ERS介導的凋亡中起著至關重要的作用,CHOP作為轉錄因子,能夠調節多種抗凋亡和促凋亡基因的表達,如 BCL-2家族蛋白,也可直接或間接影響caspase家族的活性[24-25]。隨著通氣時間的延長,上調的ERS可能通過介導細胞凋亡,影響鈣離子穩態等加速膈肌功能障礙。

綜上所述,長時間機械通氣會導致膈肌功能障礙,膈肌纖維萎縮,在機械通氣大鼠的膈肌中激活ERS,而上調的ERS可進一步引起膈肌功能障礙,抑制ERS可能是未來防治VIDD的一個重要靶點。