慢性高脂肪飲食對缺血/再灌注大鼠腦損傷影響及機制

李加善 楊德兵 彭志鋒

山西大同大學醫(yī)學院1解剖教研室，2生理教研室（山西大同 037009）

肥胖是缺血性腦卒中的主要危險因素之一［1］。全身炎癥是肥胖患者常見病理，并與其他代謝疾病發(fā)展有關，如糖尿病、動脈粥樣硬化和高血壓［2］。現(xiàn)有證據(jù)表明，肥胖可通過加重神經(jīng)炎癥和出血而惡化缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）腦損傷［3-5］。然而，在現(xiàn)有研究中，這些相關的分子機制尚未完全闡明。細胞焦亡是程序性細胞死亡新形式。細胞焦亡發(fā)生依賴于炎性Caspase和Gasdermin蛋白家族，激活的Caspase-1可使細胞內(nèi)Gasdermin D蛋白裂解為N端和C端片段；N端Gasdermin D然后在脂質(zhì)膜上形成一個孔，導致離子失衡、細胞腫脹和細胞凋亡［6］。有研究還表明，焦亡導致?lián)p傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）大量釋放到細胞外，這些分子進一步加重炎癥［7-8］。其中高遷移族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1）屬于DAMPs。HMGB1直接與Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）4結(jié)合，并進一步誘導活化B細胞的核因子-κ輕鏈增強子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）活化，從而導致炎癥反應擴大［9-10］。但是肥胖是否通過細胞焦亡及HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路加重I/R腦損傷仍不明確。因而，本研究旨在評估慢性高脂肪飲食（chronic high-fat diet，HFD）對大鼠腦I/R損傷后細胞焦亡及HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響，有可能為治療缺血性腦卒中提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組雄性Wistar大鼠（體質(zhì)量180 ～ 220 g）購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（動物許可證號：SCXK（京）2019-0011）。它們被安置在溫度可控的環(huán)境中［（25 ± 1）℃，12 h光周期］。在適應7 d后，按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常飲食（normal diet，ND）組（n= 30）和HFD組（n= 30）。每組再分別分為Sham組和I/R組兩個亞組，每個亞組15只。正常飲食組以標準飼料飼養(yǎng)，含有碳水化合物495.3 g、脂肪83.7 g、蛋白質(zhì)269.0 g、維生素65.4 g和纖維34.3 g；HFD組以高脂/高碳水化合物飲食飼養(yǎng)，高脂飲食主要含有碳水化合物190.76 g、脂肪342.24 g、蛋白質(zhì)353.6 g、膽固醇10 g、維生素85.19 g、DL-蛋氨酸3 g、纖維13.21 g、酵母粉1 g和氯化鈉1 g（購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所）。每周測定食物攝入量和體質(zhì)量。在16周結(jié)束時采集血樣以測量代謝參數(shù)。I/R手術后24 h，對所有大鼠進行神經(jīng)行為學評估，然后處死。

1.2 實驗試劑HE和尼氏染料（美國Sigma公司）；甘油三酯、總膽固醇和血糖檢測試劑盒（天根生物科技有限公司）；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、Caspase-1、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、HMGB1、TLR4和NF-κB抗體（美國Sigma公司）。

1.3 大鼠I/R模型制備腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠。然后在頸部腹面作中線切口顯露右側(cè)頸總動脈，用鈍性解剖法分離迷走神經(jīng)附近鄰近組織的肌肉，分離頸動脈分叉，仔細分離頸外動脈、頸內(nèi)動脈、枕動脈和翼腭動脈。將細絲經(jīng)頸外動脈插入頸內(nèi)動脈阻斷大腦中動脈（middle cerebral artery occlusion，MCAO），阻斷60 min后牽拉單絲誘導再灌注，在再灌24 h后進行相關檢測。模型成功標志是手術后出現(xiàn)手術側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)。Sham組除不插入細絲外，其余手術均相同。

1.4 代謝血液參數(shù)測定在正常飲食或HFD攝入16周后，從尾靜脈收集各組大鼠血液樣本。然后將樣品在4 ℃下以1 600 ×g離心10 min。根據(jù)制造商的說明，使用比色測定法評估甘油三酯、總膽固醇和血糖水平。

1.5 神經(jīng)行為學測定I/R后24 h，通過使用5點神經(jīng)缺陷量表來確定神經(jīng)行為學變化。評分為0，無明顯神經(jīng)功能缺損；1分，無法伸展對側(cè)前爪；2分，向同側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，軀干向?qū)?cè)傾斜；4分，不能自發(fā)或無意識地行走［11］。

1.6 組織病理學測定I/R后24 h，采用經(jīng)心臟灌注固定處死大鼠。在深度鎮(zhèn)靜麻醉下，打開胸腔以暴露心臟。接下來，立即通過左心室灌注0.9%生理鹽水溶液，以清除循環(huán)系統(tǒng)中血液，然后加入4%多聚甲醛用于組織保存。然后收集腦皮層梗死周圍區(qū)域，并進一步在4%多聚甲醛中固定24 h。隨后，將所有樣品嵌入石蠟中，并用切片機切成5 μm厚的切片。冠狀切片用HE染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.7 尼氏染色通過尼氏染色法測定梗死周圍區(qū)域區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量。進行5 μm厚的切片，并在37 ℃下用0.5%甲酚紫溶液染色10 min。在光學顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)變化，存活神經(jīng)元具有完整邊界和圓形細胞核，而死亡神經(jīng)元具有細胞質(zhì)收縮。測定并比較每組大鼠大腦皮層梗死周圍區(qū)域活細胞密度。

1.8 蛋白質(zhì)制備和western blotting分析I/R后24 h，迅速收集腦組織并在冷裂解緩沖液中勻漿。然后，將勻漿在4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，收集上清液。通過使用Bradford蛋白質(zhì)測定法測定總蛋白質(zhì)濃度。將每個樣品中25 μ總蛋白裝入10%凝膠中并進行電泳。將分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。通過將PVDF膜與5%脫脂牛奶孵育2 h來阻斷非特異性蛋白結(jié)合。將膜與一級抗體在4 ℃下孵育過夜，主要包括NLRP3、Caspase-1、IL-1β、HMGB1、TLR4和NF-κB抗體。采用TBST洗滌PVDF膜，然后在室溫下與抗兔IgG或山羊抗鼠IgG二級抗體孵育2 h。利用化學發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測相關蛋白表達并攝片，采用Quantity one圖像分析軟件對目標條帶吸光度積值進行分析。

1.9 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HFD對大鼠代謝影響與ND組相比，HFD組大鼠體質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪組織重量增加（P＜0.05）；此外，HFD組大鼠血清甘油三酯、總膽固醇和葡萄糖水平均增加（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組大鼠喂養(yǎng)3個月后代謝參數(shù)的比較Tab.1 Comparison of metabolic parameters between two groups of rats after 3 months of feeding ±s

表1 兩組大鼠喂養(yǎng)3個月后代謝參數(shù)的比較Tab.1 Comparison of metabolic parameters between two groups of rats after 3 months of feeding ±s

組別ND組HFD組t值P值n 30 30體質(zhì)量（g）398.5 ± 45.3 523.6 ± 61.9 26.437＜ 0.001脂肪組織（g）19.8 ± 23.4 41.2 ± 5.3 39.075＜ 0.001甘油三酯（mg/dL）73.8 ± 7.8 96.7 ± 10.2 14.378 0.006總膽固醇（mg/dL）54.6 ± 5.9 88.6 ± 9.7 31.849＜ 0.001葡萄糖（mg/dL）134.6 ± 16.2 153.8 ± 17.3 11.536 0.017

2.2 HFD對I/R大鼠神經(jīng)行為學影響無論ND或HFD，I/R組大鼠神經(jīng)功能缺損評分高于Sham組（P＜0.05）。在I/R組中，HFD大鼠神經(jīng)功能缺損評分高于ND大鼠（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較Tab.2 Comparison of neuron function defect scores of rats in each group ±s

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較Tab.2 Comparison of neuron function defect scores of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n t值P值15 15 ND 0 2.8 ± 0.3 46.936＜ 0.001 HFD 0 3.7 ± 0.4 57.423＜ 0.001 9.834 0.028

2.3 HFD對I/R大鼠組織病理學影響在Sham組中，ND大鼠實質(zhì)組織和細胞排列正常，而HFD大鼠核固縮的萎縮細胞略有增加。在I/R組中，不論ND或HFD大鼠表現(xiàn)為同側(cè)皮層形成大量空泡空間和不規(guī)則細胞結(jié)構(gòu)，而且HFD大鼠比ND大鼠具有更多的受損細胞（圖1）。

圖1 各組大鼠典型HE染色（× 40）Fig.1 Typical HE staining of rats in each group（× 40）

2.4 HFD對I/R大鼠神經(jīng)元存活影響在Sham組中，ND和HFD大鼠尼氏陽性細胞在大腦中廣泛表達。在I/R組中，ND和HFD大鼠同側(cè)皮層神經(jīng)元細胞質(zhì)收縮和核固縮（圖2）。與Sham組相比，I/R大鼠大腦皮層存活神經(jīng)元減少（P＜0.05），而且HFD大鼠存活神經(jīng)元數(shù)量少于ND大鼠（P＜0.05）（表3）。

圖2 各組大鼠典型尼氏染色（× 40）Fig.2 Typical Nissl staining of rats in each group（× 40）

表3 各組大鼠存活神經(jīng)元密度比較Tab.3 Comparison of survival neuron density of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 t值4.784 8.173 P值0.107 0.025 ND 100.0 ± 0.0 37.3 ± 4.2 63.740＜ 0.001 HFD 93.5 ± 9.6 20.6 ± 2.4 75.382＜ 0.001

2.5 HFD對I/R大鼠細胞焦亡相關蛋白影響與Sham組相比，I/R組中ND和HFD大鼠細胞焦亡相關蛋白（NLRP3、Caspase-1、IL-1β）表達增加（P＜0.05），而且HFD大鼠細胞焦亡相關蛋白（NLRP3、Caspase-1、IL-1β）表達高于ND大鼠（P＜0.05）（圖3和表4-6）。

圖3 各組大鼠典型細胞凋亡相關蛋白的表達Fig.3 Expression of typical apoptosis related proteins of rats in each group

表4 各組大鼠NLRP3蛋白表達的比較Tab.4 Comparison of NLRP3 protein expression of rats in each group ±s

表4 各組大鼠NLRP3蛋白表達的比較Tab.4 Comparison of NLRP3 protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 175.3 ± 18.6 9.164 0.012 HFD 105.8 ± 11.2 227.6 ± 24.4 14.826＜ 0.001 t值1.946 7.139 P值0.832 0.036

表5 各組大鼠Caspase-1蛋白表達的比較Tab.5 Comparison of Caspase-1 protein expression of rats in each group ±s

表5 各組大鼠Caspase-1蛋白表達的比較Tab.5 Comparison of Caspase-1 protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 198.3 ± 20.1 13.836＜ 0.001 HFD 103.6 ± 11.3 247.6 ± 25.0 17.649＜ 0.001 t值1.238 6.972 P值0.896 0.039

表6 各組大鼠IL-1β蛋白表達的比較Tab.6 Comparison of IL-1β protein expression of rats in each group ±s

表6 各組大鼠IL-1β蛋白表達的比較Tab.6 Comparison of IL-1β protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 t值2.182 6.549 P值0.814 0.041 ND 100.0 ± 0.0 203.3 ± 21.1 17.378＜ 0.001 HFD 108.5 ± 11.7 268.1 ± 28.4 23.538＜ 0.001

2.6 HFD對I/R大鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路影響與Sham組相比，I/R組中ND和HFD大鼠HMGB1及其下游因子TLR4和NF-κB表達增加（P＜0.05），而且HFD大鼠HMGB1及其下游因子TLR4和NF-κB表達高于ND大鼠（P＜0.05）（圖4和表7-9）。

圖4 各組大鼠典型HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白的表達Fig.4 Expression of typical HMGB1/TLR4/NF-κB protein of rats in each group

表7 各組大鼠HMGB1蛋白表達的比較Tab.7 Comparison of HMGB1 protein expression of rats in each group ±s

表7 各組大鼠HMGB1蛋白表達的比較Tab.7 Comparison of HMGB1 protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 217.3 ± 22.8 24.4280＜ 0.001 HFD 101.5 ± 10.6 300.2 ± 32.4 68.354＜ 0.001 t值0.084 9.152 P值0.969 0.013

表8 各組大鼠TLR4蛋白表達的比較Tab.8 Comparison of TLR4 protein expression of rats in each group ±s

表8 各組大鼠TLR4蛋白表達的比較Tab.8 Comparison of TLR4 protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 207.3 ± 21.4 22.638＜ 0.001 HFD 95.5 ± 9.8 310.3 ± 32.0 74.736＜ 0.001 t值1.043 9.376 P值0.925 0.011

表9 各組大鼠NF-κB蛋白表達的比較Tab.9 Comparison of NF-κB protein expression of rats in each group ±s

表9 各組大鼠NF-κB蛋白表達的比較Tab.9 Comparison of NF-κB protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 175.2 ± 19.6 9.543 0.010 HFD 101.4 ± 9.8 283.1 ± 29.0 52.457＜ 0.001 t值0.028 11.649 P值0.987 0.006

3 討論

本研究主要觀察HFD攝入對I/R大鼠腦損傷影響，以及細胞焦亡和HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在其中的作用。研究結(jié)果表明，HFD攝入惡化了I/R大鼠神經(jīng)功能預后，并降低了神經(jīng)元存活率。值得注意的是，本研究結(jié)果首次表明，在HFD喂養(yǎng)大鼠腦I/R損傷中，細胞焦亡和HMGB1信號通路顯著增強。

給大鼠喂養(yǎng)HFD，持續(xù)16周，這種飲食模式已被廣泛報道會誘發(fā)多種代謝疾病，如非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化，以及腎、腸、腦和胰腺損傷［12-14］。與我們的數(shù)據(jù)一致，盡管ND組和HFD組大鼠食物攝入量沒有區(qū)別，但HFD組大鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪以及血清甘油三酯、總膽固醇和葡萄糖水平均增高。這些參數(shù)證實了HFD攝入大鼠存在與肥胖相關的代謝障礙。之后我們探討了HFD攝入對短暫MCAO引起的I/R大鼠腦損傷的影響。在I/R組中，與ND大鼠相比，HFD大鼠神經(jīng)功能缺損評分增高。這些數(shù)據(jù)表明，HFD攝入加劇了I/R大鼠腦損傷嚴重程度。我們還通過HE染色觀察了各組大鼠同側(cè)大腦皮層組織病理學變化。在I/R組中，HFD大鼠比ND大鼠具有更多的受損細胞。這一發(fā)現(xiàn)與尼氏染色測定的存活神經(jīng)元密度一致。在I/R組中，具有清晰邊界且無細胞質(zhì)收縮的完整神經(jīng)元數(shù)量減少。在兩種飲食之間進行比較，與ND大鼠相比，HFD大鼠存活神經(jīng)元減少更多。這些數(shù)據(jù)表明，HFD會促進神經(jīng)元死亡，從而導致I/R損傷后大腦功能紊亂。

凋亡和壞死這兩種類型的細胞死亡都可以被調(diào)節(jié)，每種類型都有不同的形態(tài)學和生化特征［15-17］。細胞焦亡也被歸為程序性壞死形式。盡管細胞焦亡受信號通路調(diào)節(jié)，但細胞焦亡發(fā)生均需要質(zhì)膜破裂，這種現(xiàn)象會導致細胞內(nèi)物質(zhì)排出到細胞外，進而引發(fā)炎癥反應［18-19］。目前，抑制這些信號通路被視為缺血性腦卒中一種有前途的治療方法。例如，給予MCC-950（NLRP3炎性體特異性抑制劑），可有效減少炎性信號和腦水腫，從而改善I/R大鼠腦梗死體積和神經(jīng)功能［20］。這一證據(jù)支持細胞焦亡參與I/R大鼠腦損傷。因此，我們探討了HFD喂養(yǎng)大鼠I/R損傷后細胞焦亡的作用。結(jié)果顯示，在HFD喂養(yǎng)I/R大鼠中，與細胞焦亡相關蛋白質(zhì)（NLRP3、caspase-1和IL-1β）在腦梗死周圍顯著增加。這些結(jié)果表明，長期食用HFD會加劇I/R大鼠細胞焦亡。如上所述，細胞焦亡通過調(diào)節(jié)細胞脂質(zhì)膜雙層中孔形成來誘導溶解性細胞死亡。從而導致DAMPs釋放到細胞外空間。HMGB1是一種常見DAMPs，參與腦I/R損傷后炎癥信號啟動和傳播［21］。該分子介導TLR4/NF-κB信號通路，是缺血大腦促炎癥中起重要作用介質(zhì)［22-23］。TLR4/NF-κB級聯(lián)激活對I/R腦損傷產(chǎn)生有害影響，而抑制這些信號傳導可減少腦梗死［24］。此外，NF-κB還調(diào)節(jié)NLRP3表達，NLRP3是炎癥復合體主要成分；這種調(diào)節(jié)會導致細胞焦亡［25］。因此，我們進一步研究腦I/R損傷后HMGB1、TLR4和NF-κB信號蛋白表達。在I/R組中，與ND大鼠相比，HFD大鼠HMGB1、TLR4和NF-κB表達增高。因此，HFD加劇I/R損傷后HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路。下一步研究需采用上述信號通路特異性抑制劑來確認該信號通路在細胞焦亡中具體作用。

總之，本研究結(jié)果表明，HFD攝入會加重大鼠腦I/R損傷后細胞焦亡，并增強HMGB1/TLR4/NFκB信號通路表達，從而導致I/R后不良結(jié)局。