連接蛋白43在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞自噬中的作用

熊思淵 王璐 田俊杰 谷揚(yáng) 馬雅靜 馬克濤 張瑩瑩1，3， 李新芝

1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（新疆石河子 832000）；2國(guó)家衛(wèi)健委中亞高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（新疆石河子 832000）；石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院3生理學(xué)教研室，4病理生理學(xué)教研室（新疆石河子 832000）；5石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（新疆石河子 832000）

心腦血管疾病是造成全球人類發(fā)病和死亡的主要原因。目前，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）被認(rèn)為是引起心血管疾病的主要病因［1］。AS斑塊不穩(wěn)定、破裂是導(dǎo)致臨床急性心血管事件的主要原因，而巨噬細(xì)胞在AS斑塊的起始、生長(zhǎng)和最終破裂過(guò)程中發(fā)揮核心作用。故以巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，深入探究其在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用是至關(guān)重要的。前有研究表明，在AS斑塊形成過(guò)程中，單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁下內(nèi)皮，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）或其他修飾脂蛋白后轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，此過(guò)程會(huì)促使巨噬細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，刺激血管中膜平滑肌細(xì)胞增殖，加速AS發(fā)展［2］。據(jù)報(bào)道，ox-LDL、缺氧、活性氧等因素可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［3］。自噬是一種細(xì)胞依賴溶酶體進(jìn)行自我保護(hù)的分解代謝途徑，該過(guò)程能維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［4］。自噬能對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)及抗氧化應(yīng)激、降低細(xì)胞凋亡的作用。此外，巨噬細(xì)胞自噬能減少泡沫細(xì)胞的積累，增強(qiáng)AS斑塊穩(wěn)定性，從而抑制斑塊的形成和發(fā)展［3，5］。

縫隙連接蛋白（connexin，Cx）是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接的關(guān)鍵蛋白，其能在細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，構(gòu)建細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系，且連接蛋白形成的半通道和縫隙連接通道在AS的發(fā)展中也起著重要的作用。大量研究表明，Cx43在AS發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。前有學(xué)者提出，Cx43能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞遷移能力，參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，且細(xì)胞自噬過(guò)程伴隨著Cx43表達(dá)變化［6］，提示Cx43可能通過(guò)影響巨噬細(xì)胞自噬參與AS的發(fā)生發(fā)展。所以，為了明確Cx43是否參與巨噬細(xì)胞自噬過(guò)程，從而影響AS的發(fā)生與發(fā)展，本研究通過(guò)ox-LDL構(gòu)建巨噬細(xì)胞自噬及泡沫化模型，再應(yīng)用qRT-PCR、Western blot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Cx43特異性阻斷劑Gap26及Gap19對(duì)RAW264.7細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3B表達(dá)。本研究的創(chuàng)新之處在于探究Cx43在ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7自噬中的作用，為臨床上以Cx43為靶向治療AS提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞系購(gòu)自武漢普諾賽公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CFX96 Touch熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠圖像成像儀為美國(guó)BIO-RAD公司；非接觸式激光共聚焦顯微鏡（LSM510）為德國(guó)CarlZeiss公司。ox-LDL購(gòu)自中國(guó)廣州亦源公司；Anti-Cx43抗體、Anti-Beclin1抗體、Anti-LC3B抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；小鼠抗β-actin單抗、小鼠抗GAPDH單抗、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG/FITC標(biāo)記二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG/FITC標(biāo)記二抗均購(gòu)自于中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；上下游引物購(gòu)自上海生工生物股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備在DMEM培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清及青鏈霉素，配置成完全培養(yǎng)液。將1.5 × 105個(gè)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)液中，并放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，取對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞，分成Control組、ox-LDL組（100 μg/mL ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h）、ox-LDL+Gap19組（20 nmol/L Gap19預(yù)處理30 min后加入100 μg/mL ox-LDL共同孵育24 h）及ox-LDL+Gap26干預(yù)組（20 nmol/L Gap26預(yù)處理30 min后加入100 μg/mL ox-LDL共同孵育24 h）。

1.2.2 油紅O染色將密度為80% ～ 90%的RAW264.7細(xì)胞消化后接種于含蓋玻片的六孔板中，取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞分成Control組及ox-LDL組，干預(yù)24 h后，按照南京建成說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行油紅O染色，最后用水性封固劑封片，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)按照Total RNA提取試劑盒（Omega公司）說(shuō)明書(shū)提取RAW264.7細(xì)胞總mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermofisher公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再取1 μL cDNA，并按照說(shuō)明書(shū)配好擴(kuò)增體系，加入反轉(zhuǎn)錄模板，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器中，94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，26個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)后，根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算并分析各組細(xì)胞Cx43、Becline-1、LC3B的mRNA表達(dá)水平。相關(guān)引物序列號(hào)如下：GADPH：Forward：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，Reverse：CGACATACTCAGCACCAGCATCAC；Cx43：Forward：TCAAGCCTACTCAACTGCTGG，Reverse：TGTTACAACGAAAGGCAGACTG；Beclin-1：Forward：GTAGGGATGGAAGGGTCTAAG，Reverse：GCCTGGGCTGTGGTAAGTAAT；LC3B：Forward：CATGAGCGAGTTGGTCAAGAT，Reverse：TCGTCTTTCTCCTGCTCGTAG。

1.2.4 Western blot測(cè)定Cx43、Beclin-1、LC3B蛋白水平用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別加入兔抗Cx43、Beclin-1、LC3B多克隆抗體（1∶1 000）或鼠抗GAPDH、β-actin 單克隆抗體（1∶10 000），4 ℃ 過(guò)夜；TBST溶液洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（1∶15 000），室溫孵育2 h；洗膜后，暗室中，加入ECL液，X線膠片暗盒中曝光。應(yīng)用Image J 2×分析軟件分析條帶的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)Cx43、Beclin-1 、LC3B表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1.5 × 105個(gè)/孔細(xì)胞接種于24孔板后培養(yǎng)24 h，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)后，去除培養(yǎng)基并洗滌。加入2 mL 4% 多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌細(xì)胞；加入1 mL 0.2% Triton-x 100，室溫作用3 ～ 5 min后PBS洗滌；滴加BSA封閉液，37 ℃溫箱內(nèi)封閉0.5 h。用5%BSA封閉液稀釋相應(yīng)抗體：Cx43、LC3B、Beclin1，將對(duì)應(yīng)抗體滴加在培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，放置濕盒中于4 ℃ 過(guò)夜。次日，將濕盒置于溫箱中復(fù)溫30 min后洗滌，擦拭多余的PBS，37 ℃ 避光孵育相應(yīng)熒光二抗（山羊抗兔FITC）2 h，洗滌后向玻片上滴加即用型PI溶液100 μL，室溫染核5 min后洗滌細(xì)胞，最后用量抗熒光淬滅封片劑封片，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡采像并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究采用GraphPad Prism軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析，多組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞自噬蛋白LC3及Beclin-1蛋白表達(dá)的影響使用ox-LDL（100 μg/mL）干預(yù)RAW264.7細(xì)胞后，分別在0、3、6、12、24、48 h檢測(cè)LC3及Beclin-1蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖1A。在ox-LDL干預(yù)巨噬細(xì)胞的48 h內(nèi)，LC3蛋白的表達(dá)量先增加后降低，在6 h表達(dá)量最大（P= 0.041 7），在48 h表達(dá)量最低（P= 0.217 3），見(jiàn)圖1C。在ox-LDL干預(yù)巨噬細(xì)胞的48 h內(nèi)，Beclin-1蛋白的表達(dá)量先增加后降低，在12 h表達(dá)量最大（P= 0.005 4）；在48 h表達(dá)量最低（P= 0.008 7）。

圖1 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞自噬蛋白LC3及Beclin-1的影響Fig.1 Effects of ox-LDL on autophagy protein LC3 and Beclin-1 in RAW264.7 cells

2.2 ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞泡沫化使用100 μg/mL ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞0 h及24 h后，使用油紅O染色并進(jìn)行光鏡下檢查，以觀察RAW264.7細(xì)胞的泡沫化程度，見(jiàn)圖2。與Control組相比，ox-LDL處理24 h后巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多紅染的脂滴，說(shuō)明ox-LDL的干預(yù)能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，表明ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞泡沫化模型建立成功。

圖2 ox-LDL誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞泡沫化（標(biāo)尺 = 25 μm）Fig.2 ox-LDL induced cell foaming in RAW 264.7（scale = 25 μm）

2.3 ox-LDL促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)使用100 μg/mL ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h后，qRT-PCR、Western blot及免疫熒光方法檢測(cè)Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)，以明確ox-LDL對(duì)Cx43表達(dá)的影響，見(jiàn)圖3A-C。與Control組相比，ox-LDL誘導(dǎo)后，細(xì)胞中Cx43 mRNA（P= 0.000 3）和蛋白表達(dá)增加（P= 0.013 7）。圖3D熒光結(jié)果顯示，Cx43在RAW264.7細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且與Control組相比，ox-LDL組的熒光強(qiáng)度增加（P=0.000 3）。

圖3 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞Cx43蛋白的影響（標(biāo)尺= 25 μm）Fig.3 Effects of ox-LDL on Cx43 protein in RAW264.7 cells（scale =25 μm）

2.4 Cx43特異性阻斷劑Gap26及Gap19增加Beclin-1及LC3B mRNA表達(dá)見(jiàn)圖4A及4B，與Control組相比，ox-LDL組Beclin-1、LC3B的mRNA表達(dá)水平降低（PBeclin-1＜ 0.000 1，PLC3B= 0.000 4）。與ox-LDL組相比，特異性阻斷劑的干預(yù)能夠上調(diào)Beclin-1、LC3B mRNA表達(dá)水平（P26-Beclin-1= 0.006 3，P19-Beclin-1= 0.046 2，P26-LC3B= 0.000 8，P19-LC3B= 0.000 8，P26-Beclin-1= 12.55）。

圖4 Cx43特異性阻斷劑Gap26及Gap19對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞Beclin-1及LC3B mRNA表達(dá)影響Fig.4 Effects of CX43-specific blockers Gap26 and Gap19 on Beclin-1 and LC3B mRNA expression in RAW264.7 cells induced by ox-LDL

2.5 Cx43特異性阻斷劑Gap26及Gap19增加Beclin-1、LC3B蛋白表達(dá)見(jiàn)圖5，與Control組相比，ox-LDL組Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)減少（PBeclin-1=0.007 3，PLC3B= 0.016 5）。與ox-LDL組相比，特異性阻斷劑的干預(yù)能夠增加Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)（P26-Beclin-1= 0.006 8，P19-Beclin-1= 0.006，P26-LC3B= 0.039 7，P19-LC3B= 0.039 2）。見(jiàn)圖6，免疫熒光結(jié)果顯示與Western blot結(jié)果一致。Beclin1和LC3B主要定位在胞質(zhì)和胞膜上，ox-LDL能抑制Beclin1和LC3B蛋白表達(dá)（PBeclin-1= 0.000 3，PLC3B= 0.007 9）；與ox-LDL組相比，Cx43特異性阻斷劑Gap26、Gap19增加Beclin-1、LC3B蛋白表達(dá)（P26-Beclin-1= 0.017 2，P19-Beclin-1= 0.131 2，P26-LC3B= 0.002，P19-LC3B= 0.011 5）。

圖5 Cx43 在ox-LDL 誘導(dǎo)RAW264.7 發(fā)生自噬中的作用Fig.5 Role of Cx43 in autophagy of RAW264.7 induced by ox-LDL

圖6 Cx43在ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7發(fā)生自噬中的作用Fig.6 Role of Cx43 in autophagy of RAW264.7 induced by ox-LDL

3 討論

AS是一種涉及多種類型細(xì)胞的慢性炎癥性疾病［7-9］，其中脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥被認(rèn)為是AS發(fā)生的兩個(gè)關(guān)鍵誘因［10-12］，而巨噬細(xì)胞在AS的啟動(dòng)及發(fā)展過(guò)程起到重要作用。在AS斑塊形成過(guò)程中，單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁下內(nèi)皮，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞能吞噬ox-LDL或其他修飾脂蛋白而轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。因此，ox-LDL在血管內(nèi)皮中的沉積被認(rèn)為是AS的起始因素［13］。已有大量研究證實(shí)，在晚期AS中巨噬細(xì)胞自噬能發(fā)揮保護(hù)作用［14-15］。本研究采用100 μg/mL的ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞0 ～ 12 h內(nèi)，ox-LDL能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)增多，但ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 ～ 48 h能抑制RAW264.7細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)（圖1）。圖2油紅O染色顯示，ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h后，RAW264.7細(xì)胞脂質(zhì)沉積，說(shuō)明RAW264.7細(xì)胞發(fā)生泡沫化。CAO等［2，16］研究有相似的結(jié)果，100 μg/mL ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h后，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)有大量脂質(zhì)沉積，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白表達(dá)明顯降低，這些研究說(shuō)明ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞自噬隨著時(shí)間發(fā)生變化。本研究中ox-LDL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h，RAW264.7細(xì)胞發(fā)生泡沫化，且自噬蛋白LC3B及Beclin-1表達(dá)降低。由于巨噬細(xì)胞泡沫化是促進(jìn)AS發(fā)展的重要因素，因此選擇巨噬細(xì)胞泡沫化模型作為后續(xù)研究模型。

縫隙連接（gap junction，GJ）是細(xì)胞間通道，離子、小分子等物質(zhì)能通過(guò)縫隙連接進(jìn)行信息傳遞并建立細(xì)胞間聯(lián)系。Cx43是GJ蛋白亞基，幾乎在所有免疫細(xì)胞表達(dá)［17-18］。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ能通過(guò)Cx43/NF-κB通路誘導(dǎo)RAW264.7發(fā)生M1型極化，提示Cx43參與巨噬細(xì)胞功能。Cx43不僅是維持血管內(nèi)皮連續(xù)性及完整性必須蛋白［19］，其也能影響多種免疫細(xì)胞活性調(diào)節(jié)AS發(fā)生發(fā)展。血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞Cx43高表達(dá)能誘導(dǎo)或促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，例如：白細(xì)胞Cx43高表達(dá)能增強(qiáng)自身遷移及增殖能力［20］；平滑肌細(xì)胞Cx43高表達(dá)能抑制自身活性及增殖遷移能力［21］。在本研究中，與正常組相比，100 μg/mL的ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞泡沫化，且RAW264.7細(xì)胞Cx43基因及蛋白增加，但自噬蛋白LC3B及Beclin-1表達(dá)降低。Cx43特異性阻斷劑Gap26及Gap19干預(yù)后，RAW264.7細(xì)胞自噬蛋白Beclin-1及LC3B基因及蛋白表達(dá)增加，說(shuō)明阻斷Cx43的表達(dá)，促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞自噬。

SHEN等［22］報(bào)道，脂多糖能通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型NO合酶（iNOS）/黏著斑激酶（FAK）/Src通路增強(qiáng)巨噬細(xì)胞遷移能力，且巨噬細(xì)胞Cx43表達(dá)顯著增多。據(jù)報(bào)道，在基因缺陷LDL受體的小鼠中，Cx43能參與平滑肌細(xì)胞遷移過(guò)程，其也能影響內(nèi)皮細(xì)胞及白細(xì)胞功能及活性。GAO等［23］發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素能抑制蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）信號(hào)通路下調(diào)Cx43介導(dǎo)的自噬過(guò)程，從而破壞骨細(xì)胞之間聯(lián)系。研究［24-25］報(bào)道，巨噬細(xì)胞自噬過(guò)程能促進(jìn)脂滴降解以及游離膽固醇外排，抑制巨噬細(xì)胞泡沫化，該過(guò)程有助于擬轉(zhuǎn)或者改善AS。以上這些研究說(shuō)明，Cx43能通過(guò)多種信號(hào)通路及途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。在本研究中，ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7泡沫化后，Cx43表達(dá)增高，而Cx43特異抑制劑Gap26及Gap19能增強(qiáng)RAW264.7自噬，提示通過(guò)抑制Cx43表達(dá)增強(qiáng)RAW264.7自噬，有助于改善AS發(fā)生發(fā)展，這可能是今后防治AS的策略之一，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制需進(jìn)一步探究。