山竹皮單寧提取與純化工藝

蔣紅芝，韋林雙

（廣西農業職業技術大學食品藥品工程學院，南寧 530007）

山竹（Garcinia mangostanaL.）是藤黃科藤黃屬植物。一般在熱帶地區生長，分布于泰國、馬來西亞以及中國廣東省、海南省等地。新鮮的山竹顏色為暗紅色，鮮艷有光澤。放置時間過長后顏色會變成棕色，果皮會變硬，果肉會變黑色或黃色，口感變差。山竹皮性寒、味苦、澀，具有清熱解毒的功效，皮內含有單寧酸，能與微生物的蛋白質發生沉淀，使蛋白質達到凝固的效果，幫助身體殺死細菌。山竹皮中的單寧具有抗氧化活性、抗菌活性、抗炎作用、增強免疫及抗腫瘤作用等功效，廣泛應用于化妝品、食品飲料、醫藥保健等領域。山竹皮中的多酚提取工藝研究雖有報道［1］，但對山竹皮中單寧的提取［2］和純化研究較少。本研究對山竹皮中單寧的提取與純化工藝進行分析，采用乙醇為提取溶劑，大孔樹脂分離純化，旨在為山竹皮單寧提取與分離純化提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、試劑及儀器

材料：山竹購買于超市，大孔樹脂為AB-8、D101（安徽三星樹脂科技有限公司），ADS-21、HPD826、NKA-9（上海一基實業有限公司）。

試劑：單寧酸（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）、無水乙醇，分析純。

儀器：AS 220.R2 型電子天平（蘇州培科實驗室儀器科技有限公司）；2500Y 型高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；SB-5200D 型超聲波清洗機（功率200 W，寧波新藝超聲設備有限公司）；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；TU-1901 型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；RE-2000B型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；HP-B500 型電子天平（福建莆田市華杰電子儀器有限公司）；層析柱、HL-2B 型恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）；DBS-100 型電腦全自動部分收集器（上海滬西分析儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 山竹皮單寧的提取工藝流程 山竹皮→清洗→烘干（50 ℃干燥24 h）→粉碎→過篩（60 目）［3，4］→稱取一定量山竹皮粉加入一定體積的乙醇溶液→在超聲波清洗機中按一定的溫度和時間進行振蕩→冷卻→真空泵抽濾→收集濾液→定容→取一定量濾液加純化水定容至刻度線→測定吸光度，平行提取2份。

1.2.2 單寧酸的標準曲線及曲線方程 單寧酸標準液的配制：準確稱取單寧酸0.050 5 g，用純化水溶解并定容至100 mL，濃度為505 μg/mL［2］。

單寧光譜掃描吸收曲線繪制：吸取上述溶液2.5 mL，加純化水至100 mL，于波長200～400 nm 處掃描，測定吸光度，確定最大吸收波長，用于繪制標準曲線。

單寧標準曲線繪制：精密量取0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 的單寧標準液于50 mL 容量瓶中，加純化水至刻度，搖勻，在最大吸收波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.2.3 紫外分光光度法對山竹皮單寧的含量測定根據下面的算式計算單寧的提取率。

式中，c為提取液稀釋液濃度（μg/mL）；n為稀釋倍數；m為山竹皮粉末質量（g）；V為提取液的體積（mL）。

1.2.4 單因素試驗

1）乙醇體積分數對山竹皮單寧提取效果的影響。分別精密稱定8 份0.25 g 山竹皮粉，分別放入100 mL 具塞錐形瓶中，按料液比1∶200（g∶mL，下同）分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%的乙醇溶液50 mL，50 ℃超聲輔助提取40 min。

2）提取時間對山竹皮單寧提取效果的影響。分別精密稱定8 份0.25 g 山竹皮粉，按料液比1∶200，各加入50%乙醇溶液50 mL，溫度控制在50 ℃，超聲波輔助分別提取25、35、45、55 min。

3）提取溫度對山竹皮單寧提取效果的影響。分別精密稱定8 份0.25 g 山竹皮粉，按料液比1∶200，各加入50%乙醇溶液50 mL，分別設置水浴溫度為40、50、60、70 ℃，超聲波輔助提取45 min。

4）料液比對山竹皮單寧提取效果的影響。分別精密稱定1.00、0.50、0.33、0.25、0.20 g 山竹皮粉，分別放入100 mL 具塞錐形瓶中，各加入50%乙醇溶液50 mL，即料液比為1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250，60 ℃超聲輔助提取45 min。

1.2.5 正交試驗 根據單因素試驗結果，以單寧的提取率為考察指標，確定提取乙醇體積分數、提取時間、提取溫度、料液比為影響因素，每個因素取3 個水平，取各因素的最優試驗范圍［5，6］。在單因素試驗的基礎上，采用四因素三水平設計L9（34）試驗進行正交試驗優化，確定山竹皮單寧提取的最佳工藝。

1.2.6 山竹皮單寧的純化

1）大孔樹脂預處理。稱取適量5 種大孔吸附樹脂AB-8、D101、NAK-9、ADS-21、HPD826，分別裝到燒杯內，加入95%乙醇浸泡24 h 后，用純化水沖洗至無醇味，處理好的樹脂加純化水浸泡，備用。

2）大孔樹脂的篩選。靜態吸附：取減壓濃縮（50～60 ℃）后的山竹皮單寧濃縮液，稀釋一定倍數，測定其吸光度為0.471，計算出其質量濃度為0.33 mg/mL。量取30 mL 山竹皮單寧濃縮液，分別加入盛有10.00 g 已處理好的5 種大孔吸附樹脂AB-8、D101、NAK-9、ADS-21、HPD826 的燒杯中進行靜態吸附，分別在30、60 min 移取各吸附液1 mL 至50 mL 容量瓶中，用純化水定容、搖勻，測定吸光度。計算吸附量及吸附率［7］。

靜態洗脫：使用純化水洗滌大孔樹脂2 次，濾干。以乙醇作為洗脫劑，每種樹脂各稱取2.00 g，各3 份，分別加入體積分數為55%、75%、95%的乙醇溶液10 mL，洗脫30 min 取樣分析，洗脫60 min，過濾洗脫液，用純化水定容至50 mL，測定吸光度，計算洗脫率。計算式如下。

式中，m為單寧量（μg），c為濃度（μg/mL）；V為體積（mL）；n為稀釋倍數。

式中，m0為單寧初始總量（μg）；m1為吸附后的剩余量（μg）；m2為洗脫的單寧量（μg）；c0為原始濃度（μg/mL）；c1為吸附后剩余的單寧濃度（μg/mL）；c2為洗脫的乙醇含單寧的濃度（μg/mL）；V為提取液的體積（V0為原始的提取液體積、V1為加入吸附的提取液體積、V2為加入洗脫的乙醇體積）（mL）；n為稀釋倍數。

3）動態吸附和洗脫。單寧樣品的動態吸附：取適量處理好的ADS-21、HPD826大孔樹脂（各25.00 g）放入250 mL 的燒杯中，分別加入75 mL 的山竹皮濃縮液進行超聲振蕩（常溫，30、60 min）測定吸光度。通過吸附可以觀察到白色的大孔樹脂顆粒因吸附山竹單寧而變色，并帶有山竹皮本身的粉色。

單寧樣品的洗脫：將吸附好的大孔樹脂經處理后上柱，靜置一段時間，讓吸附有單寧的大孔樹脂充分填充。使用75%乙醇作為洗脫液，將樹脂中的單寧洗脫。用全自動部分收集器收集16 管洗脫液（3 min/管，恒流泵流速60 mL/min），可以觀察到流出的洗脫液第2 至第6 管均帶有顏色［8］，后面流出的變淺至無色。

4）純化的單寧產品。對洗脫液進行減壓濃縮得到純化的山竹皮單寧液，再經真空干燥即得純化后的單寧產品。

2 結果與分析

2.1 單寧吸收曲線和標準曲線方程

單寧酸的光譜掃描吸收曲線如圖1 所示。單寧在波長275 nm 處具有最大吸收峰。山竹皮提取液光譜掃描吸收曲線如圖2 所示，在波長276 nm 處具有最大吸收峰。與單寧酸對比，說明山竹皮提取液中含有單寧酸。于固定波長275 nm 處測定山竹皮提取液稀釋后的吸光度，計算山竹皮提取液中單寧的含量。在TU-1901 型雙光束紫外分光光度計定量分析界面，設置參數，輸入濃度，以純化水為參比溶液，依次測出不同濃度的吸光度［2］，儀器自動繪出標準曲線，得到線性回歸方程為c=25.889 89A+0.128 82，R＝0.999 139。

圖1 單寧酸的光譜掃描吸收曲線

圖2 山竹皮提取液光譜掃描吸收曲線

2.2 單因素試驗對山竹皮單寧提取率的影響

2.2.1 乙醇體積分數對山竹皮單寧提取率的影響在波長275 nm 處測定溶液的吸光度，以提取率代表山竹皮中單寧的含量。經過平行試驗統計［9］，乙醇體積分數對山竹皮單寧提取率的影響結果見圖3。乙醇體積分數為40%、50%時曲線呈上升趨勢，單寧含量增加。乙醇體積分數為60%、70%時曲線呈下降趨勢，單寧含量減少。當乙醇體積分數為50%時，山竹皮中單寧的含量最高。故最優乙醇體積分數為50%。

圖3 乙醇體積分數對山竹皮單寧提取率的影響

2.2.2 提取時間對山竹皮單寧提取率的影響 提取時間對山竹皮單寧提取率的影響結果見圖4。提取時間45 min 時，山竹皮中單寧的提取率最高，45 min后基本不變。有研究表明，時間過長，會使得單寧中的酚羥基經氧化反應變成酮基，從而使得提取量下降［10］。加熱時間為45 min 時提取山竹皮中單寧的含量最高，故提取時間選擇45 min。

圖4 提取時間對山竹皮單寧提取率的影響

2.2.3 提取溫度對山竹皮單寧提取率的影響 提取溫度對山竹皮單寧提取率的影響結果見圖5。提取溫度在40、50、60 ℃時，隨著溫度的提高，山竹皮中單寧的提取率呈上升趨勢，60 ℃后呈下降趨勢。故提取溫度為60 ℃時效果較好。

圖5 提取溫度對山竹皮單寧提取率的影響

2.2.4 料液比對山竹皮單寧提取率的影響 料液比對山竹皮單寧提取率的影響結果見圖6。料液比為1∶50、1∶100 時曲線下降，單寧提取率下降。料液比為1∶100 后曲線上升，單寧提取率增加，但料液比越大成本越高，故選擇了料液比為1∶200。

圖6 料液比對山竹皮單寧提取率的影響

2.3 山竹皮單寧提取的正交試驗

根據單因素試驗結果，以單寧的提取率為考察指標，設計四因素三水平L9（34）試驗［11-13］。正交設計及結果見表1，通過比較極差可知，乙醇體積分數對山竹皮中單寧的提取率影響最大，其次為提取溫度及料液比，提取時間對山竹皮中單寧的提取率影響最小。從正交試驗中可得A2B3C3D3均值最高，并對其進行驗證試驗，其提取率為10.78%。故提取山竹皮中單寧含量的最佳工藝條件為乙醇體積分數50%，料液比1∶225，提取溫度65 ℃，提取時間50 min。

表1 正交結果及分析

2.4 大孔吸附樹脂純化結果

2.4.1 靜態吸附、動態吸附結果 選取5 種不同的大孔樹脂分別對山竹皮中的單寧進行靜態吸附和動態吸附，結果見表2。由表2 可知，靜態吸附比動態吸附效果要好，吸附60 min 后基本達到平衡。綜合靜態、動態吸附的效果，NAK-9、ADS-21、HPD826 大孔樹脂吸附較好。

2.4.2 靜態洗脫結果 靜態洗脫結果見表3。用75%乙醇洗脫時，洗脫率最高，20 min 時間較短洗脫率不高，40 min 時洗脫率較高，60 min 后洗脫率下降。75%乙醇洗脫率比55%、95%的乙醇洗脫率要高。即75%乙醇洗脫率的數值較大，洗脫出來的單寧較多，所以選擇75%乙醇作為柱層析洗脫液進行洗脫。

表3 乙醇洗脫率結果

55%、95%乙醇洗脫時，NAK-9 大孔樹脂洗脫效果較差，HPD826、AB-8、D101 洗脫效果較好，但洗脫率均不高。75%乙醇洗脫時，40 min 時AB-8 樹脂洗脫率最高，60 min 后洗脫率最低，分析原因有可能是出現重新吸附造成的，ADS-21、NAK-9、HPD826洗脫效果較好，D101 穩定性較差。總體來看，ADS-21、HPD826 大孔樹脂洗脫效果較好。

由以上分析可知，ADS-21、HPD826、NAK-9 大孔樹脂吸附較好，但ADS-21、HPD826 大孔樹脂洗脫效果較好，綜合考慮吸附率和洗脫率2 個因素，得出ADS-21、HPD826為該試驗適宜的純化大孔樹脂。

2.4.3 動態洗脫（柱層析）結果 動態洗脫（柱層析）結果如圖7 所示，山竹皮單寧經ADS-21、HPD826 大孔樹脂吸附柱層析分離后，均出現1 個洗脫峰。與HPD826 大孔樹脂相比，ADS-21 大孔樹脂吸附柱層析的洗脫峰較窄，洗脫出來的單寧比較集中，即分離洗脫的效果較好［4］，所以選擇ADS-21 大孔樹脂對山竹皮單寧進行洗脫。

圖7 ADS-21、HPD826 柱層析結果對比

3 小結

1）以山竹皮為原料通過單因素試驗與正交試驗確定山竹皮中單寧最優提取工藝為50%乙醇，料液比1∶225，提取溫度65 ℃，提取時間為50 min，提取率可達10.78%。

2）從5 種大孔樹脂中篩選出吸附和洗脫效果較好的ADS-21、HPD826 大孔樹脂，根據ADS-21、HPD826 大孔樹脂靜態、動態吸附，靜態、動態洗脫試驗結果，得出ADS-21 大孔樹脂為分離純化山竹皮中單寧的最佳樹脂。