湖北省鄖西核桃炭疽病病原菌的分離鑒定

曹春霞，姚經武，黃大野，王蓓蓓，鄭嬌莉，楊 丹

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

核桃（Juglans regia）炭疽病是核桃生長過程中的重要真菌病害，可危害其葉片、果實、芽、花苞和嫩梢，引起葉斑、落葉、花腐、果腐和枝梢枯死，嚴重制約著核桃產業的發展，影響農民收益［1］。其病原菌主要有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）［2，3］、果生刺盤孢菌（Colletotrichum fructicola）［4］、核桃盤二孢菌（Marssonina juglandis）［5］、暹羅刺盤孢菌（Colletotrichum siamense）［6，7］和尖孢刺盤孢復合種（Colletotrichum acutatum）［8］。湖北省鄖西縣核桃炭疽病大發生，但病原種類尚不明確。

本研究以2022 年鄖西縣棋盤山核桃基地中的病葉為材料，旨在以形態學鑒定為基礎，結合分子生物學（ITS和看家基因）對病原菌進行分離鑒定，以期明確該地區核桃炭疽病的病原種類，為該病害的后續研究和防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核桃炭疽病的感病葉片以及健康葉片、果實于2022 年采自鄖西縣棋盤山核桃基地。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L。

E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit、TaKaRa PCR Mix RR901A、武漢瑞華光照培養箱、哈東聯超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、BIO-RAD C1000 Touch Thermal Cycler PCR 儀、君意JY300C 電泳儀、OLYMPUS BX43 顯微鏡、ABI 3730XL 測序儀、恒溫水浴鍋、培養皿等。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離純化 采用組織分離法［9］。新鮮病葉清洗干凈，將葉片病健交界處組織切成小塊，用75%乙醇消毒3 s，放入5%次氯酸鈉中浸泡3～5 min，無菌水漂洗3 次，待小塊組織表面晾干，用接種針將組織塊移入PDA 培養基表面，每平板放5 片，培養皿密封后放入25 ℃培養箱培養。待組織邊緣長出菌絲后，將菌絲塊轉接到新的PDA 平板上進行純化培養，待純化的菌落產孢后，通過單孢分離獲得純的病原菌。

1.2.2 形態學鑒定 將病原菌接種在PDA 平板上，置于25 ℃條件下培養10 d，觀察菌落形態和顏色；培養15 d 后，用無菌水將孢子洗脫下來，三層擦鏡紙過濾，顯微鏡下觀察分生孢子形態和大小，并拍照保存。

1.2.3 分子生物學鑒定 收集病原菌菌絲，采用E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit 提取病原菌DNA，所用引物為ITS和3 對看家基因［6］（表1）。25 μL PCR 體系為Premix Taq（TaKaRa Taq ?Version 2.0 plus dye）12.5 μL，DNA（40 ng/μL）1 μL，引物F/R（10 μmol/L）各1 μL，滅菌蒸餾水9.5 μL。PCR 反應程序為94 ℃預變性5 min；每個循環94 ℃變性30 s；56 ℃退火45 s；72 ℃延伸45 s，共32 個循環；最后72 ℃延伸5 min，反應結束后，凝膠電泳回收擴增片段，純化后的DNA 片段送北京擎科生物科技有限公司測序。

表1 擴增ITS、ACT、GAPDH 和HIS3 基因序列的引物

1.2.4 致病性鑒定 分別采用菌絲塊和分生孢子液刺傷接種離體核桃葉片和果實進行致病力測定。在菌絲塊接種試驗中，病原菌在PDA 平板上25 ℃培養2～3 d，然后用孔徑6 mm 的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊，接種于核桃葉片和果實上的刺傷點（菌絲面向下貼緊葉片和果實表面）。每片葉片接種2 個菌絲塊，每處理重復6 片葉片；每個果實接種1個菌絲塊，每處理重復6 個果實。

在分生孢子液接種試驗中，首先用無菌水從培養了15 d 的菌落平板上洗下分生孢子，并用三層擦鏡紙過濾收集孢子液，離心后PDB 重新懸浮。通過血球計數板將孢子液濃度調至1×106個/mL。在每片待接種的植株葉片刺傷點上放置6 片滅菌的濾紙片（直徑6 mm）。吸取分生孢子液20 μL 滴加在各濾紙片上。每片葉片接種6 個濾紙片，每處理重復6 片葉片；每個果實滴加20 μL 孢子液，每處理重復6 個果實。

接種完成后，將葉片和果實置于放有濕潤吸水紙的淺盤中，保鮮膜密封后置于25 ℃和12 h 光照/12 h 黑暗條件下保濕培養，接種發病后，采用組織分離法分離發病部位病原菌，鑒定分離到的病原菌性狀是否與原始菌株相同。

1.3 系統進化樹分析

將ITS、ACT、GAPDH和HIS3基因的序列合并后，利用ML 法構建系統發育樹，自展支持率分析采用1 000 次重復，并使用稻瘟菌菌株Magnaporthe oryzaPO-FA28 的對應基因序列為外群［10］。

2 結果與分析

2.1 核桃葉部病害田間癥狀

對鄖西縣棋盤山核桃基地的核桃葉部病害進行了田間癥狀觀察，發現炭疽病是其重要病害，主要為害葉片。發病初期為圓形小斑點，隨后在葉尖及葉緣形成大小不同的褐色病斑，呈不規則形狀，發病后期葉部病斑極易碎裂、脫落，形成穿孔癥狀，葉片焦枯脫落。

2.2 病原菌的形態鑒定

采用組織分離法分離得到真菌菌株NYF2-2，菌株在25 ℃條件下生長良好，產生白色菌絲，向四周輻射狀生長，隨著培養時間延長，慢慢形成圓形菌落，7 d 左右長滿培養皿，初期菌絲為白色絮狀，菌落邊緣光滑規則。培養10 d 后，菌落背面可見黃綠色色素沉積（圖1A 和圖1B）；菌株分生孢子是單孢，長橢圓形，兩端鈍圓，孢子大小為（14.79±1.78）μm×（4.49±0.41）μm（圖1C）。經菌落特性和孢子形態初步確定NYF2-2 屬于刺盤孢屬（Colletotrichumspp.）真菌。

圖1 菌株NYF2-2 在PDA 培養基上的菌落形態（25 ℃，10 d）和分生孢子

2.3 病原菌的分子鑒定及系統進化分析

利用引物ITS4/ITS5及3 對看家基因引物對真菌DNA 進行擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳均可檢測到單一清晰的條帶，條帶回收后測序。測得所有序列在NCBI 網站上進行BLAST 分析，結果表明，所有序列都與膠孢炭疽菌的同源性最高，均可達到100%；系統發育樹結果表明，菌株NYF2-2 和4 個膠孢炭疽菌菌株（C.gloeosporioidesCBS 112999、C.gloeosporioideslq27、C.gloeosporioideslq30 和C.gloeosporioideslq35）聚為同一分支（圖2）。因此，根據形態學特征及多基因系統發育分析，將病原菌NYF2-2 鑒定為膠孢炭疽菌。

圖2 菌株NYF2-2 基于ITS、ACT、GAPDH 和HIS3 4 個基因合并序列用NJ 法構建的系統發育樹

2.4 病原菌的致病力測定

菌絲塊接種離體核桃葉片4 d 后病斑明顯，呈黑褐色（圖3B）。菌絲塊接種離體核桃果實7 d 后，病斑清晰可見（圖3F），隨著侵染時間增加，病斑面積逐漸擴大；分生孢子液接種離體核桃葉片5 d 后出現明顯病斑（圖3D），分生孢子液接種離體核桃果實7 d 后出現明顯病斑（圖3H），后期病斑處易形成橘紅色孢子堆，所有病斑形態與田間葉片發病癥狀一致，發病的病斑經過重新分離，重新獲得的菌株與原始菌株培養形態相同，表明菌株NYF2-2 是核桃炭疽病的病原菌。

圖3 菌株NYF2-2 接種離體核桃葉片和果實的發病癥狀

3 小結與討論

湖北省鄖西縣核桃基地炭疽病發生危害程度日益嚴重。為了有效控制核桃炭疽病的暴發流行，明確病原種類十分必要。本研究于2022 年6 月從核桃發病葉片上分離到1 株強致病力菌株NYF2-2，將菌株進行離體接種可使核桃葉片和果實發病，回接病葉和果實后再分離，得到的菌株與原分離菌株培養形態相同，經柯赫氏法則驗證該菌株為核桃炭疽病的病原菌。通過培養特性和多基因序列（ITS、ACT、GAPDH和HIS3）分析，將菌株NYF2-2 鑒定為膠孢炭疽菌，表明膠孢炭疽菌是引起鄖西縣核桃產區炭疽病暴發流行的主要致病菌。菌株NYF2-2 在PDA 培養基上的培養形態為灰白色，7 d 后逐漸變為灰綠色。分生孢子單孢、無色、長橢圓形，大小為（14.79±1.78）μm×（4.49±0.41）μm，與已報道的膠孢炭疽菌的分生孢子形態、大小基本一致［10］。

有研究對其他省市的核桃炭疽病病原進行了報道，如山東省濟南市［7］的核桃炭疽病病原菌為暹羅刺盤孢菌，陜西省核桃炭疽病的病原為咖啡刺盤孢（C.coffeanum）［11］等。本研究是關于湖北省鄖西縣核桃炭疽病病原的首次報道。1 種炭疽菌可以侵染幾種寄主植物，也可以幾種炭疽菌侵染1 種寄主植物。如引起葡萄炭疽病的有膠孢炭疽菌C.gloeosporioides［12］，引起辣椒炭疽病的有C.acutatum、C.truncatum、C.fructicola和C.siamense4 種炭疽菌［13-15］，而C.acutaum和C.gloeosporioides均可以引起草莓炭疽病［16］。本研究僅對從病葉上分離到的1 株強致病性菌株進行了鑒定，至于核桃上是否存在其他炭疽菌還需進行后續研究，同時，該病原菌的生物學特性、所致病害的發病規律等還需繼續研究，以便制定行之有效的防治方案。