基于TRV病毒的工業大麻(Cannabis sativa L.)VIGS體系的優化

劉俊飛，楊曉娟，潘根，鄭建樹，黃思齊*

(1.中國農業科學院麻類研究所，湖南長沙 410221；2.中國農業科學院深圳農業基因組研究所，廣東深圳 518100)

大麻(Cannabis sativaL.)是大麻科(Cannabinaceae)大麻屬(Cannabis)一年生植物，別名火麻、漢麻、線麻等[1]。工業大麻是人類栽培利用最早的古老作物之一，原產于中亞和東亞，分布于世界各地，在我國有著悠久的栽培史，也是具有高附加值的特種經濟作物。其種子、纖維和花葉中的天然活性成分被廣泛應用于食品、紡織、材料、化妝品和醫藥等領域[2]。

目前，工業大麻的遺傳轉化體系不穩定、轉化效率低，這制約了對其抗逆性、基因功能驗證的研究。病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是一種不依賴轉基因技術的基因功能缺失研究方法[3]。轉基因法研究基因功能不僅試驗周期長、成本高且需要遺傳轉化，相比于傳統的轉基因技術，VIGS 技術具有沉默效率高、周期短、操作簡單、經濟實惠等優點，而且不需要事先知道并克隆基因全長，也無須建立遺傳轉化體系，只需要一段300～500 bp 的基因片段就能快速獲得表型，進行基因功能的驗證[4]，其應用范圍也更加廣泛，被越來越多地應用于不同作物的基因功能研究中。

VIGS 是利用病毒載體攜帶植物目的基因片段，通過各種方式侵染植物，重組病毒在植物中復制產生雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)，在植物自身防衛反應轉錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)的機制作用下，dsRNA 進一步產生siRNA(small interference RNA，siRNA)，該產物能夠誘導與其具有同源性的植物內源目的基因mRNA 的降解，根據表型變異來進行基因功能分析，實現植物基因功能的快速鑒定[5]。VIGS體系不僅在煙草和擬南芥等模式植物上成功建立，而且也廣泛應用于木薯[6]、蘋果[7]、玉米[8]、棉花[9]、葡萄[10]等作物中。煙草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus，TRV)具有基因組較小、可以侵染植物生長點、不產生典型病毒性狀、便于改造等優點，是目前在植物中應用最廣泛、效果最好的VIGS 病毒載體[11]，對包括煙草[12]、辣椒[13]等在內的植物均有較好的侵染效果。

目前已有在工業大麻中構建VIGS體系的相關報道，其中采用了棉花皺葉病毒(Cotton leaf crumple virus，CLCrV)作為載體，在侵染試驗中，嘗試了3 種不同農桿菌菌株LBA4404、GV3101 和AGL1，結果發現只有使用AGL1 轉化的幼苗表現出了預期的表型效果[14]。本研究以煙草脆裂病毒(TRV)為基礎研制的VIGS 載體，其TRV 介導的VIGS 技術具有沉默株率高、病毒癥狀溫和、沉默持續性強等優點，但在不同宿主植物中，其沉默效率和成功率均有一定的差別[15]。研究顯示，VIGS 系統的沉默株率受多種因素的影響。第一，插入基因序列與靶基因序列的同源性越高，其沉默效率就越高[16]。第二，基因片段的長度、方向和折疊方式對沉默的效果也有一定的影響。有研究[17]顯示，在病毒載體中，基因片段的長度存在一個有效的區間，其最佳長度為200～350 bp。第三，環境因子對病毒載體的復制有一定的影響，沉默后的植物生長環境對沉默載體的沉默效果也有明顯的影響。研究[18]顯示，當培養溫度提高時，VIGS 病毒的效果會明顯減弱。第四，VIGS 的沉默株率受接種方式的影響，應針對不同的植物選擇最佳的接種方式。目前的接種方式有:注射法[19]、灌根法[20]和真空浸潤法[21]。VIGS 技術雖得到了廣泛的應用，但工業大麻植物的再生體系和遺傳轉化體系尚不完善，且工業大麻VIGS 沉默株率和沉默效率存在一定的差別。

本研究以工業大麻品種云麻7 號為材料，以工業大麻八氫番茄紅素脫氫酶基因為報告基因(CsPDS)，利用TRV 介導的VIGS 技術沉默工業大麻CsPDS基因，當出現植株白化現象即可表明PDS基因沉默，配合通過實時熒光定量PCR 檢測，驗證基因表達量沉默，在此基礎上，研究侵染時苗齡、不同注射方法、不同工作液OD值、不同工作液菌液比例、不同PDS片段、不同農桿菌、侵染后不同生長溫度對工業大麻基因沉默株率的影響，以期建立并優化出工業大麻最適的VIGS 沉默條件，為后續工業大麻的興趣基因功能研究奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云麻7 號種子由中國農業科學院麻類研究所原一年生麻類作物遺傳育種團隊提供。將云麻7號種子用4% NaClO 滅菌消毒10 min，用無菌去離子水沖洗，于培養箱中萌發2 d。將發芽2 d 的幼苗轉移至m(營養土)∶m(蛭石)＝3∶1 的土壤中。幼苗在晝夜溫度為24 ℃/16 ℃，光周期為16 h/8 h(明/暗)，相對濕度為60%，光強度為700 μmol/m2的培養箱中生長，一周齡后用于試驗。

pTRV 病毒載體購自長沙天楚生物公司；大腸桿菌(Escherichia coli)菌株為DH5α，根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株為GV3101、EHA105、AGL1。

1.2 病毒載體的構建

已知的工業大麻CsPDS全長1728 bp，從中選擇一個300 bp 的片段，并利用同源重組方法將該片段插入pTRV2 載體中。在篩選過程中，選擇抗卡那霉素(Kanamycin)作為篩選基因，同時選擇EcoR1 和BamH1 作為酶切位點。

首先將工業大麻CsPDS基因的DNA 提取出來，并使用適當的引物擴增出300 bp 的CsPDS基因片段。接下來，準備pTRV2 載體，并通過EcoR1 和BamH1 酶對PCR 產物和pTRV2 載體進行酶切。這一過程會生成互補的黏性末端，然后進行同源重組，將回收的目標片段與pTRV2 載體連接，形成重組產物。最后，將重組產物導入適當的細菌宿主中，進行轉化過程，使其擴增。最終，利用抗生素篩選確認帶有目標插入片段的細菌克隆。

1.3 侵染液的制備

將經過正確克隆和測序的質粒載體轉化到農桿菌中(包括GV3101、EHA105 和AGL1 菌株)。在含有卡那霉素(Kan 50 mg/mL)和利福平(Rif 100 mg/mL)雙重抗性的LB 固體培養基上挑選單個克隆，并使用10 mL 含有卡那霉素和利福平兩種抗性的LB 液體培養基來活化農桿菌。

當菌液OD600＝1.0 后，在4000 r/min 的條件下，室溫離心10 min 收集菌液。將收獲的菌塊用10 mmol/L 的MgCl2懸浮至指定濃度(OD600＝0.5/1.0)，確保懸濁液中含有10 mmol/L 的MES-KOH和100 μmol/L 的Acetosyringone(乙酰丁香酮)。將懸濁液在室溫下黑暗環境靜置3～6 h，即可得到侵染工作液。

侵染時試驗組為TRV1 空載體工作液與TRV2 工作載體工作液按1∶1 的體積比進行混合，同時設置TRV1 與TRV2 空載體對照。

1.4 沉默體系優化探索

1.4.1 侵染方法的探索

選擇1 周齡的云麻7 號進行葉背注射法試驗。葉背注射法是使用去針頭的1 mL 一次性注射器，將含有PDS基因的病毒載體侵染液(農桿菌菌種為GV3101、工作液濃度OD600＝0.8、接種后溫度24 ℃)通過去針注射器壓迫的方式將混合液注入試驗材料的第一片真葉。同時，在本試驗中還嘗試了真空滲透法進行侵染，具體步驟為將試驗材料的真葉完全浸沒于含有PDS基因的病毒載體的工作液中，然后在真空壓強為0.07 MPa 的條件下進行真空處理，處理時間分別設置為5、10、15 min。

1.4.2 高效PDS片段的探索

將工業大麻PDS基因的CDS 序列輸入VIGS 預測網站(https:/ /vigs.solgenomics.net/)，并以擬南芥、川桑和甜瓜作為模板植物，選擇3 個大小為300 bp 的片段構建載體TRV2::PDS1、TRV2::PDS2、TRV2::PDS3。其引物分別為:PDS1F:GTGAGTAAGGTTACCGAATTCCTGTATGCCCATAGT；PDS1R:AGGTGATCATATGTGCTCGGTACCGGATCC；PDS2F:GTGAGTAAGGTTACCGAATTCTTTGGCTTTTGGGTCT；PDS2R:TGGACGAGGAGAGCCCTCGGTACCGGATCC；PDS3F:GTGAGTAAGGTTACCGAATTCTCTGCCAGCTCCCTT；PDS3R:CCATGCTTCTCCTGACTCGGTACCGGATCC(定量為采用葉背注射法，農桿菌菌株為GV3101，接種后在24 ℃條件下進行，工作液濃度設定為OD600＝0.8。)

1.4.3 高效工作液濃度的探索

TRV 作為載體的VIGS 工作液由TRV1 空載體菌液和搭載目的基因的TRV2 載體菌液混合而成，工作液OD600的數值對農桿菌侵染有重要的影響。本研究采用葉背注射法，選擇工業大麻PDS基因的960～1259 bp 片段作為目標片段。農桿菌菌株為GV3101，在接種后保持溫度為24 ℃。通過調節工作液的濃度來探索不同OD600值(包括0.5 和1.0)下VIGS 對PDS基因沉默效果的影響。

1.4.4 高效農桿菌菌種的探索

采用葉背注射法將攜帶pTRV2::CsPDS1 的農桿菌菌株GV3101、EHA105 和AGL1 分別用于侵染工業大麻的第一片真葉。定量試驗中，選擇工業大麻PDS基因的960～1259 bp 片段作為目標區域，工作液的濃度設定為OD600＝1.0，接種后保持溫度為24 ℃。

1.4.5 侵染苗齡的探索

將1 周齡和3 周齡的云麻一號葉片使用葉背注射法進行注射。1 周齡葉片較厚且柔軟，易于注射；3 周齡葉片變薄且堅硬，難以進行注射。

1.5 數據處理

以白化植株出現的百分率標記為VIGS 的沉默株率，計算方法為:植株沉默株率＝(白化株數/轉化總株數)×100%。

1.6 侵染后白化基因表達量變化

選擇出現白化表型的工業大麻植株，取其第一對真葉作為注射葉片(機械損傷)。隨后，分別采集第二對和第三對真葉進行取樣。使用預冷的剪刀迅速剪下葉片，并將其放入液氮中進行冷凍處理，隨后儲存在-80 ℃冰箱備用。接下來，采用Trizol 方法提取RNA，并使用HisScript III RT SuperMix for qPCR(南京諾維贊生物公司)將其反轉錄成cDNA。最后，利用實時熒光定量PCR(RTqPCR)檢測目標基因的表達情況。RT-qPCR 引物為F:GCCCCAGACAAAGATCTCCT，R:AAATTCTCTGACCCCGAGCA；工業大麻內參基因ACTIN 為F:CCAATAGCCTTGCATTCCAT，R:TCGATTGGAAAGCCGAATAC。

2 結果與分析

2.1 工業大麻沉默體系優化

由圖1 可以看出，PDS基因沉默后，植株都出現了不同程度的白化現象。

圖1 PDS 基因沉默后植株表型Fig.1 Plant phenotypes after PDS gene silencing

圖2 注射PDS1、PDS2、PDS3 及空載體(CK)片段后兩周的植株Fig.2 Plants injected with PDS1， PDS2， PDS3 and empty vector(CK)fragments for two weeks

圖3 兩個不同OD600工作液的侵染效果Fig.3 Infection effects of working solutions at two different OD600

圖4 3 種不同農桿菌侵染效果Fig.4 Infection effects of three Agrobacterium strains

圖5 不同真空時間抽真空法侵染后的植株Fig.5 Plants infected by vacuum pumping method at different vacuum time

圖6 白化后的工業大麻葉片Fig.6 Cannabis leaves after albinism

圖7 兩株VIGS 處理后工業大麻出現白化和未出現白化的真葉中PDS 基因表達量Fig.7 The expression levels of PDS genes in the albino and non albino true leaves of two VIGS treated cannabis plants

2.1.1 侵染苗齡的確定

VIGS 侵染的效率與病毒感染的細胞數量有直接關系，感染細胞數越多，沉默效率越高。采用注射法侵染時，當苗齡超過3 周，葉片逐漸變薄變硬，葉背注射難以實現，細胞感染數量變少，而在1 周齡時葉片最容易注射，故選用1 周齡作為注射時間。

2.1.2 不同PDS片段注射后的表型

使用葉背注射法進行侵染試驗，工作液的濃度設定為OD600＝0.8。農桿菌菌株采用GV3101，TRV2 載體分別攜帶PDS基因的不同片段，包括TRV2::PDS1(960～1259 bp)、TRV2::PDS2(126～425 bp)、TRV2::PDS3(618～917 bp)。每個組分別侵染了15 株植株。結果顯示，PDS1 和PDS2 組的白化率均為13.3%，而PDS3 組沒有出現白化現象。

表1 不同PDS 片段注射后的白化效率Table 1 Albinism efficiency after injection of different PDS fragments

2.1.3 不同OD值工作液注射后的表型

采用葉背注射法，在使用工業大麻PDS的960～1259 bp 片段、農桿菌菌種為GV3101 的情況下，工作液OD600＝0.5 以及OD600＝1.0 組分別侵染一周齡工業大麻10 株。當工作液OD600＝1.0 時，有5 株樣品出現白化現象，沉默株率為50%，當工作液OD600＝0.5 時有1 株樣品出現白化現象，沉默株率為10%。

表2 不同濃度工作液注射后的白化效率Table 2 Albinism efficiency after injection of working solution at different concentrations

2.1.4 不同農桿菌菌株注射后的表型

在定量為葉背注射法、使用工業大麻PDS的960～1259 bp 片段、工作液OD600＝1.0 的情況下，分別用GV3101、EHA105、AGL1 3 種攜帶TRV2::PDS的農桿菌菌株侵染工業大麻，每組分別侵染一周齡工業大麻10 株。侵染3 周后，注射GV3101 菌株的有3 株出現白化，注射EHA105 菌株的未出現白化，注射AGL1 菌株的有1 株出現白化。

表3 不同農桿菌注射后的白化效率Table 3 Albinism efficiency after injection of different Agrobacterium strains

2.1.5 抽真空法真空時間的探索

采用真空滲透法侵染1 周齡工業大麻，在真空壓力為0.7 MPa 條件下，分別抽真空5、10、15 min。每組各設10 株重復，在生長3 周后發現3 組樣品均無白化現象，表明抽真空法在云麻7 號上較難實現。

2.1.6 葉片的侵染效果

在侵染后2～3 周，植株出現白化現象，可以觀察到第一對真葉由于注射引起機械損傷及老化，出現干枯壞死現象，靠近注射葉的第二對真葉出現白化，且僅接種植株的新生葉片局部白化，表明感染是局部性的，TRV 在細胞間和植物體全身的運動都受到限制，尤其是在整個植物體中的運動受限。

2.2 沉默后基因表達量分析

選取兩株VIGS 處理后的工業大麻植株，分別為出現(W)和未出現(G)白化的植株。取其第二對(W-2、G-3)及第三對真葉(W-3、G-3)進行RT-qPCR 檢測。根據結果可知，出現白化的植株，第二對真葉(W-2)的PDS基因表達量相比其他葉片明顯降低，可證明白化現象是由PDS基因沉默導致。

3 討論

人們常通過沉默或敲除八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)基因，觀察是否獲得白化表型植株，以此驗證沉默體系是否工作。以TRV 病毒為基礎的VIGS 系統具有寄主范圍廣、沉默效率高、持續時間長、病毒癥狀輕、分生感染等優勢，是VIGS 中應用最為廣泛的一種系統[22]。但是，VGIS 載體的使用受宿主的限制，大多數只能用于煙草和番茄。

有報道使用棉花皺葉病毒(CLCrV)為載體[14]，并以AGL1 作為侵染農桿菌，得到的沉默效率高于使用GV3101 農桿菌的。但在不同宿主植物中，同樣的載體選擇，其沉默效率和成功率都有一定的差別。TRV 載體沉默株率高，病毒癥狀溫和，沉默持續性強。本研究以煙草脆裂病毒(TRV)為基礎探索VIGS 載體，結果表明，當使用TRV 時，GV3101 農桿菌侵染會得到預期的結果。

目前，VIGS 沉默的主要途徑有機械、金屬離子轟擊和農桿菌等，其中農桿菌介導技術相對于其他途徑更加簡便、有效，因而得到了廣泛的應用[23]。農桿菌介導的途徑有多種，如:牙簽刺傷法、真空滲透法、葉背注射法、高壓噴槍法等。本試驗采用葉背注射法進行侵染，得到了沉默效果，采用真空浸透法未出現沉默，可能是菌液進入植株的數量不足，可以探討是否可將兩種方法結合使用。保證帶有重組載體的菌液進入植株，是確保VIGS 技術成功的關鍵因素。

本研究使用了葉背注射法和抽真空法使菌液進入植物體內，其中抽真空法適用于葉片較窄且較硬的植物，注射法適用于葉片較厚且軟的植物[24]。工業大麻在3 周齡前葉片較厚而柔軟，使用注射法可將菌液順利注射進入植物體內，但此時葉片較小，進入的菌液量較少，這可能導致了葉片不能完全白化。本研究使用三周齡前的工業大麻進行抽真空法侵染，而工業大麻在3 周齡后葉片逐漸變薄變硬，易于抽真空法菌液的進入[25]，這可能是本研究抽真空法未能出現表型的原因之一。

在本試驗所有白化結果中，只有靠近注射葉的第二對真葉出現白化，白化葉片也并未像馬鈴薯、棉花等作物一樣整株白化，即單株沉默效果較低，說明TRV 在工業大麻細胞間和全身的運動都受到限制，下一步研究方向為提高病毒對工業大麻的侵染效率，以優化沉默體系。

有研究[26]顯示，在適宜溫度條件下，SiRNA 能夠調控VIGS 的活性，但在較高的溫度條件下，VIGS基因會迅速退化，無法保持持久、穩定的沉默。此外，很多抗病毒的通路還取決于溫度的調控，比如AGOs、DCLs、RDR[27]。病毒在入侵宿主細胞后，必須在適當的溫度下進行繁殖[28]。除了對低溫依賴性的病毒以外，大部分的植物病毒都能在20～25 ℃發生感染[29]。本研究侵染后將植株放在24 ℃環境下培養，可根據溫度調控進一步優化體系。本研究使用的材料為2～3 周齡的工業大麻，對于一些在更大周齡表達的功能基因，該VIGS體系是否起作用還有待商榷，后續需使用花期的工業大麻繼續探索其沉默體系，沉默該時期表達的基因，以驗證基因功能。

對于工業大麻VIGS 沉默體系，目前還存在沉默株率低、沉默葉片數較少、等待周期較長、條件不夠完善等缺點，需要繼續優化體系，以保證更高效的沉默。

4 結論

研究結果表明，侵染的苗齡、侵染方式、目的基因的片段、菌液濃度、農桿菌的菌株對VIGS 沉默效果均具有明顯的影響，其中最適宜的體系為使用GV3101 農桿菌，PDS基因選取片段為960～1259 bp 或126～425 bp，接種濃度OD600為1.0，最佳的接種方式是在一周苗齡采用葉背注射法，接種后培養溫度為24 ℃，培養2～3 周即可出現表型。